摘要: 目的建立抑制肠上皮细胞基因组中Muc2 基因表达的CRISPR/Cas9 系统并探索粘蛋白Muc2 在鼠李糖乳杆菌GG株 (LGG)抑制大肠杆菌K1(Escherichia coli, E.coli k1)株E44 黏附和侵袭肠上皮中的作用机制。方法设计2 个长20~25 bp 的 sgRNA分别靶向Muc2,合成sgRNA寡核苷酸序列并构建CRISPR表达载体,转染野生型人结肠癌Ht29细胞,蛋白免疫印迹法 检测抑制效率及通过MTT法检测其细胞活力及生长情况后,竞争性排斥分析验证粘蛋白Muc2在益生菌抑制E44黏附侵袭肠 上皮中的作用。结果目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的lenticrisprv2质粒载体中且序列正确;稳定抑制Muc2表达的 细胞株筛选成功;Muc2基因沉默后,与空白对照组相比,其表达水平明显降低,抑制率可达81%(P<0.01);黏附侵袭实验中E44 相对黏附率为72.23%(P<0.01),相对侵袭率为81.49%(P<0.01),益生菌LGG的抑制E44 黏附和侵袭作用明显下调。结论 Muc2基因下调明显降低益生菌抑制E44黏附和侵袭肠上皮细胞的能力,提示益生菌刺激Muc2表达上调可能是其强化加固肠粘 膜屏障和拮抗致病菌功能的关键性机制之一,并可为肠道细菌性感染疾病的预防治疗提供了一个新手段。