南方医科大学学报 ›› 2019, Vol. 39 ›› Issue (10): 1173-.doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.10.07
曹玉梅,孙四玉,杨冬梅,霍艳杰,邱飞,谢雪娇,庹勤慧
摘要: 目的构建重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP,并探讨Daxx对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导VSMCs增殖的影响。方 法基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法构建重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP。经测序和酶切验证后,用重 组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP与包装辅助载体共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液纯化后感染VSMCs, Western blot法鉴定过表达Daxx的VSMCs株。然后将pCDH-EGFP病毒液感染的空载体细胞和pCDH-Daxx-EGFP病毒液的 感染的过表达Daxx细胞都分成无血清培养基孵育组和AngⅡ孵育组。用MTT法检测细胞活性、流式细胞术观察细胞周期、划 痕法检测细胞迁移、Western blot法检测细胞中p-Akt蛋白表达。结果基因测序与双酶切鉴定表明Daxx基因慢病毒表达载体 构建成功;与Vector组比,转染Daxx组、蛋白表达水平明显增加(P<0.05);经AngII处理后,转染Daxx组细胞活性、S期细胞比率 和与细胞迁移率与Vector 组比较显著降低(P<0.05);转染Daxx组细胞中p-Akt 蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论成功构建 了重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP和过表达Daxx 的VSMCs株;Daxx能显著抑制AngII诱导的VSMCs增殖和迁移, 其机制可能与p-Akt蛋白有关。