南方医科大学学报 ›› 2019, Vol. 39 ›› Issue (03): 344-.doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.03.13
杜艳丽,韩宗利,王湘雨,万成松
摘要: 目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐(polyP)的可靠方法。方法提取并纯化大 肠杆菌O157:H7 野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察 细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80 ℃速冻溶解、-20 ℃速冻溶 解、60 ℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定 荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1 两个突变株polyP 含量。结果应用 360 nm 激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm 激发波长,DAPI-polyP 最大发射波长为550 nm;应用 405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光(425~475 nm),应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光(500~560 nm);最佳 细菌前处理方法为-80 ℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5(R2=0.991),测定各株菌polyP量,其中野生株显 著高于ppk1缺失突变株。结论DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在 肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持。