在我国，口腔癌是人类癌症疾病中最高发的肿瘤之一，舌癌又作为口腔癌中恶性程度最高的癌症性疾病之一^[1-2]。近几十年来，舌癌的治疗大多运用手术、放疗等手段，但术后复发率高且毒副作用大^[3-4]。所以寻找适合的药物治疗舌癌已成为科研界密切关注的问题。

和厚朴酚（HNK）是在中药厚朴中提取出的双酚类成分，其生物学活性和药理作用包括抗肿瘤、抗氧化、消炎等^[5-7]。已有研究表明和厚朴酚可抑制结肠癌、鼻咽癌等癌细胞的生长，且曲莉等研究发现HNK可通过Pi3k/ Akt信号通路影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，但具体作用机制尚不明确^[8-9]。目前尚未有人在舌癌细胞中研究和厚朴酚所起的作用，因此，本文将研究HNK体外对人舌鳞癌CAL-27细胞的影响及作用机制。

细胞：人舌鳞癌CAL-27细胞系购自中国科学院上海细胞库。

药品与试剂：HNK，纯度：>98%（批号：JZ15031502，南京景竹生物科技有限公司）；噻唑蓝试剂盒（碧云天）。

仪器：酶标仪（Bio TeK）；倒置荧光显微镜（Olympus）；蛋白印迹系统（Bio-RAD）。

人舌鳞癌CAL-27细胞用含10%血清、100 kU/L^-1青霉素及100 μg/mL链霉素DMEM培养基，并放在含5% CO₂、37 ℃的恒温箱内培养，待细胞长至皿底85%左右时进行常规传代或后续细胞实验。

将CAL-27细胞分成4组：对照组细胞不加和厚朴酚。实验组细胞分别加入低、中、高浓度（20、40、60μmol/L）的HNK处理。

HNK配置方法：先用二甲基亚砜（DMSO）溶解至100 mmol/L，再用无血清培养基稀释到20、40、60 μmol/L。

细胞分组及处理同1.3，约5000/孔的浓度的CAL-27细胞接种至96孔板，贴壁后加入和厚朴酚培养液，24 h后加入10 μL MTT溶液且继续培养4 h，吸掉培养液并加入150 μL的DMSO，检测酶标仪490 nm处的吸光度值（A_{490 nm}）。

生长抑制率（%）=（A_对照组－A_实验组）/A_对照组×100%。

细胞分组及处理同1.3，约5×10⁵/孔的浓度的CAL-27细胞接种至6孔板，细胞均匀长满后用200 μL枪头进行均匀划痕，磷酸盐缓冲液（PBS）洗去划落的细胞，加入HNK培养液，24 h后用显微镜观察并拍照记录。

细胞分组及处理同1.3，约1×10⁵/孔的浓度的CAL-27细胞接种至6孔板，贴壁后加入HNK培养液，24 h后吸掉培养液，用PBS清洗3次后加入Hoechst33342染色剂且继续孵育30 min，吸掉液体后再用PBS清洗3次，荧光显微镜观察并记录。

细胞分组及处理同1.3，约1×10⁵/孔的浓度的CAL-27细胞接种至6孔板，贴壁后加入HNK培养液，24 h后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化细胞，离心并用流式缓冲液吹散细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI后避光室温处理15 min，流式细胞仪检测并记录。

细胞分组及处理同1.3，约3×10⁶/皿的浓度的CAL-27细胞接种至大皿（直径为10 cm），经HNK处理24 h后，用细胞刮刀收集各组细胞并提取总蛋白，定量、制样及制胶后进行电泳、转膜及封闭，孵育一抗和二抗后用化学发光试剂（ECL）显影并记录。

SPSS21.0软件进行统计学分析，用均数±标准差表示，两组间比较使用t检验，多组间比较用使单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

与对照组相比，经不同浓度HNK处理CAL-27细胞24 h后，细胞增殖能力均明显受到抑制，且随HNK浓度增加受到抑制的效果更加显著（P < 0.01，图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 HNK对CAL-27细胞增殖的抑制作用 Fig.1 Inhibitory effect of HNK on proliferation of CAL-27 cells. **P < 0.01 vs the control group

经统一划痕和不同剂量的HNK处理24 h后，分析两个时间点下细胞的迁移面积。与对照组相比，实验组的细胞划痕愈合能力明显减弱，划痕面积愈合百分比明显减少，迁移能力明显下降，且随着HNK浓度增加抑制细胞迁移的作用更加明显（图 2A、B，P < 0.01）。

图 2(Fig.2)

图 2 HNK作用CAL-27细胞24 h后对迁移能力的影响 Fig.2 Migration ability of CAL-27 cells after 24 h of treatment with HNK using a scratch test (Original magnification: × 40) (A) and Statistical analysis of cell migration rate(B). **P < 0.01 vs the control group

经Hoechst33342染料染色后，用荧光显微镜观察对照组细胞形态规则且胞核呈暗蓝光；经低、中、高3个剂量的HNK处理24 h后，数目减少、核固缩且胞核呈亮蓝光。与对照组比较随HNK浓度增加CAL-27细胞凋亡率显著增加（图 3、4A、4B，P < 0.01）。

图 3(Fig.3)

图 3 荧光显微镜观察HNK作用CAL-27细胞24 h后细胞形态学影响 Fig.3 Effect of HNK on nuclear morphology of CAL-27 cells observed with fluorescence microscopy (×200)

图 4(Fig.4)

图 4 HNK对CAL-27细胞凋亡率的影响 Fig.4 Effect of the HNK on apoptosis rate of CAL-27 cells using flow cytometry to detected cell apoptosis (A) and Statistical analysis of cell apoptosis rate(B). **P < 0.01 vs the control group

与对照组比较经不同浓度HNK处理24 h后，p-Pi3k、p-Akt蛋白表达量明显减少（P < 0.05），且Akt蛋白表达量基本不变（图 5A、B，P>0.05）。

图 5(Fig.5)

图 5 CAL-27细胞p-Pi3k、p-Akt、Akt蛋白的表达 Fig.5 Expression of p-Pi3k, p-Akt, Akt proteins of CAL-27 cells by Western blot (A) and statistical analysis of p-Pi3k, p-Akt and Akt protein expressions in CAL-27 cells. β-actin was used as a blank control (B). **P < 0.05 and P > 0.05 vs the control group

与对照组比较经不同浓度HNK处理24 h后，p-Fak蛋白表达量明显下降（P < 0.01），而Fak蛋白表达量无明显变化（图 6A、B，P>0.05）。

图 6(Fig.6)

图 6 HNK对CAL-27细胞p-Fak、Fak蛋白的表达的影响 Fig.6 Expression of p-Fak、Fak proteins of CAL-27 cells by Western blot (A) and statistical analysis (B). β-actin was used as a blank control. **P < 0.01 vs the control group

与对照组比较经不同浓度和厚朴酚处理24 h后，MMP2和MMP9蛋白表达量明显下降（图 7A、B，P < 0.05）。

图 7(Fig.7)

图 7 CAL-27细胞MMP2、MMP9蛋白的表达 Fig.7 Expression of MMP2、MMP9 proteins of CAL-27 cells by Western blot (A) and statistical analysis (B). β-actin was used as a blank control. *P < 0.05, **P < 0.01 vs the control group

与对照组比较经不同浓度和厚朴酚处理24 h后，Bcl-2蛋白表达量明显降低而Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量明显升高（图 8A、B，P < 0.01），呈一定的浓度依赖性。

图 8(Fig.8)

图 8 CAL-27细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达 Fig.8 Expression of Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3 proteins of CAL-27 cells by Western blot (A) and statistical analysis (B). β-actin was used as a blank control. **P < 0.01 vs the control group

舌鳞状细胞癌是口腔癌中的一种顽固且浸润性强的癌症，它的发病率逐渐增加且更加年轻化^[10-12]，常规的手术治疗可发生远处转移^[13]。但近年来，中药单体成分在抗肿瘤领域中的研究逐渐上升，和厚朴酚价格低廉且功效好^[14-15]。并且有研究表明，HNK有多种药理作用，并能起到抑制肺癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞的作用^[16-17]，但是否能起到抑制舌癌CAL-27细胞生长的作用尚不清楚。

本实验用MTT法观察HNK对人舌鳞癌CAL-27细胞的影响，检测结果发现，HNK能明显抑制舌癌CAL-27细胞体外增殖，且随HNK浓度增加而抑制作用增强，提示HNK有明显的抗舌癌细胞作用。进而采用划痕实验观察了舌癌细胞的迁移情况，随着HNK浓度的上升迁移能力明显下降。又用Hoechst33342染色法和流式细胞术检测CAL-27细胞凋亡情况的结果发现，在倒置荧光显微镜下观察到对照组细胞形态正常，细胞核完整，染色质均匀；实验组细胞形态不规则，核膜消失，染色质皱缩，胞核碎裂呈亮蓝色，且随着HNK浓度的增加细胞核越来越亮，与HNK在神经胶质瘤细胞中所起到效果相同^[18]。

Pi3k/Akt信号通路在细胞增殖过程中起正调控作用^[19]。在骨肉瘤细胞中，HNK可激活Bax、Cleaved-Caspase-3和PARP的蛋白表达并抑制Bcl-2的蛋白表达来抑制骨肉瘤细胞生长^[20]。另有研究表明，抑制Pi3k/Akt通路也可抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡^[21]。因此，我们采用Western blot蛋白印迹法检测了Pi3k/ Akt通路及凋亡相关蛋白在舌癌细胞中的表达情况，Cleaved-Caspase-3细胞凋亡中扮演重要角色，其活化后可使线粒体外膜通透性增加，从而导致细胞程序性死亡^[22-24]。经HNK处理24 h后CAL-27细胞中p-Pi3k、p-Akt、Bcl-2蛋白表达量减少且Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量增加，且与HNK呈一定的浓度依赖关系，与上述文献的结果一致，进一步证明了HNK的抗舌癌细胞作用。

局部粘着斑激酶Fak是一种与细胞生长及迁移密切相关的蛋白酪氨酸激酶，大量研究表明Fak在多种肿瘤细胞中存在高表达的现象，因此抑制Fak的活化可能成为治疗肿瘤细胞潜在的新靶点^[25-28]。Pi3k/Akt通路在肿瘤细胞迁移过程中也起到重要的调控作用，其下游的MMP2和MMP9也是细胞迁移过程中具有重要作用的蛋白酶，可以被上述通路激活从而增强肿瘤细胞的迁移作用^[29-31]。因此我们同样采用Western blot蛋白印迹法检测了经HNK处理24 h后CAL-27细胞中迁移相关蛋白Fak、MMP2和MMP9表达情况，结果显示随着HNK浓度的增加p-Fak蛋白表达量显著下降而Fak蛋白表达量基本不变，MMP2和MMP9蛋白表达量明显减少，这与其它已报道文献中抑制肿瘤迁移现象结果相同^[32-34]。

综上所述，HNK抑制舌癌CAL-27细胞体外增殖、迁移和诱导CAL-27细胞凋亡可能是通过调控Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3和p-Fak的蛋白表达量来实现的。本研究为临床开发中药治疗舌癌提供了实验依据。后续将进行体内试验研究，并探讨HNK抑制舌癌细胞的具体分子机制。