2020, Vol. 40
2. 儿童发育疾病研究教育部重点实验室//国家儿童健康与疾病临床医学 研究中心//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014
2. Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders/National Clinical Research Center for Child Health and Disorders/China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders/Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Chongqing 400014, China
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一类广泛使用的增塑剂，被广泛应用于食品包装、医疗器械等各种塑料制品中，是一类重要的全球性有机污染物[1]。一旦进入生态系统中，将随饮水、食物摄入、和空气吸入等途径进入人体。其中婴幼儿和儿童的暴露途径更为多样化[2]，包括母乳喂养、婴儿护理产品和塑料玩具的广泛使用等。研究表明，DBP具有雌激素效应，是一种环境内分泌干扰物[1]。婴幼儿处于发育的关键期，DBP对婴幼儿的污染风险不容忽视。大量研究表明DBP具有胚胎发育、生殖毒性以及内分泌干扰效应[3-4]。而近年来DBP对未成熟脑的神经毒性也受到越来越多的重视。DBP神经毒的机制研究非常广泛，本研究有别于传统的围绕DBP的拟雌激素特性的作用，针对新生儿中枢神经系统发育过程中的最先出现的部位和细胞，探索DBP神经毒性的关键环节。本课题组前期[2, 5]通过动物实验模型已经发现DBP围生期染毒后可引起子代大鼠认知功能障碍、脑电节律慢化、海马神经细胞凋亡等神经毒性，且可导致子代大鼠海马神经细胞ERβ、BDNF表达降低，推测DBP可能通过雌激素信号通路导致了海马神经细胞结构和功能损害，从而导致子代大鼠认知功能障碍。为进一步探索DBP神经毒性的可能分子机制，本研究通过体外培养原代大鼠海马神经元，模拟系统性调控的体内模型，深入研究DBP对原代培养的海马细胞结构和功能的损伤，并探索DBP是否通过GABA参与的ERs-BDNF-NPY雌激素信号通路发挥其神经毒性作用，为有效规避DBP的神经毒性提供重要的实验基础。
1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物实验采用无特定病原体级孕18 d SD大鼠，实验所用SD大鼠均购自重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（渝）2017-0012，置于SPF级动物实验室饲养。12 h光亮/黑暗条件。在动物饲养和实验过程中，符合作者所在单位实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。
1.1.2 主要试剂DBP（Sigma- Aldrich，纯度99.0%），DMEM/F12培养基（Hyclone SH30023.01B），Neurobasal培养基（Gibco），B27培养基添加剂（Gibco），L-谷氨酰胺（Sigma），澳洲胎牛血清（Life），EDTA-胰蛋白酶（Gibco），小鼠抗大鼠NF200Millipore，Cell Counting Kit 8（日本同仁CK04）。ERβ兔多克隆抗体（Abcam），BDNF兔多克隆抗体（Abcam），NPY兔多克隆抗体（Abcam），PVDF膜（Millipore），BCA法蛋白定量试剂盒（Thermo scientific），超敏ECL化学发光试剂盒（BioRad）。细胞外液：NaCl 140（mmol/L），KCl 5（mmol/L），CaCl2 1.8（mmol/L），MgCl2·6H2O 1（mmol/L），HEPES 10（mmol/L），D-Glucose 10（mmol/L）。电极内液：KCl 130（mmol/L），MgCl22（mmol/L），HEPES 10（mmol/L），EGTA10（mmol/L），ATPNa2 5（mmol/L）。
1.2 方法 1.2.1 胎鼠海马神经元的体外分离培养及鉴定（1）将爬片放于六孔板内，生物安全柜中紫外灯照射30 min后，用多聚赖氨酸包被后在生物安全柜中风干。孕18 d SD大鼠，通过腹腔内注射10%水合氯醛进行麻醉，解剖取出胎鼠，在冰水混合物中洗涤1次，将胎鼠断头快速取出脑组织并将其放入含有预冷的DMEM/F12的玻璃培养皿中，剥出海马组织，剥离脑膜和血管，加入0.5% EDTA-胰酶消化10 min后加入血清停止消化，细胞筛网过滤，800 r/min、4 ℃下离心10 min。离心后，弃去上清液，加入4 mL种植培养基，重悬，并将20 μL重悬液吸入细胞计数板，通过Count Star细胞计数器计数后接种在含有细胞爬片的六孔板中，接种密度为（5~10）×105/孔，放置于37 ℃、5% CO2孵箱。4 h后全量换液。神经元生长培养基以后每3.5 d量换液1次。将细胞培养至第10天以进行免疫荧光鉴定。（2）免疫荧光鉴定胎鼠海马原代神经元：取培养至10 d的正常神经元细胞爬片，用神经元神经丝蛋白（NF）200抗体结合山羊抗兔CY3行免疫荧光鉴定。
1.2.2 药物浓度筛选海马神经元原代培养4 d后将海马神经元暴露在含有终浓度为0（对照）、0.1、1、10 g/L DBP的培养基中，置入含有5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养96 h，光镜下观察神经元的形态，选取合适的浓度以备后续研究，染毒选取24、48、96 h 3个时间点，探索DBP对神经元成熟的毒性作用。
1.2.3 DBP染毒后海马神经元轴突变化海马神经元原代培养至第4天时，将DBP染毒96 h组和同时间点正常对照组，用NF200抗体进行免疫荧光检测神经元轴突，NIS-viewer软件进行轴突长度测量。
1.2.4 透射电子显微镜观察海马神经元超微结构海马神经元原代培养至第4天时，将DBP染毒96 h组和同时间点正常对照组，去除培养基，收集细胞于离心管中，加入戊二醛固定，染色，透射电镜观察神经元超微结构。
1.2.5 膜片钳技术记录海马神经元动作电位海马神经元原代培养至第4天时，将DBP染毒96 h组和同时间点正常对照组，去除培养基，置于细胞外液中，采用Muticlamp-700B膜片钳系统进行全细胞模式动作电位记录。用pCLAMP10.3软件分析动作电位发放频率。
1.2.6 CCK-8检测海马神经元的活性在包被过的96孔板中接种100 μL的单细胞悬液，4 h后培养基全量换为无血清培养基，每3 d无血清培养基半量换液，在培养箱中培养细胞至第4天时向培养板中加入DBP，分别于染毒后24、48、96 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中培养4 h，用酶标仪测定在波长450 nm的吸光度A450 nm。
1.2.7 Western blot测定海马神经元BDNF，NPY，ERβ表达用全蛋白提取试剂盒提取两组各时间点细胞蛋白，BCA法测定细胞蛋白浓度后行蛋白免疫印迹实验测定BDNF，NPY，ERβ蛋白表达水平，用ImageJ软件分析2组各时间点BDNF，NPY，ERβ级内参的灰度值，BDNF，NPY，ERβ水平分别用BDNF/β-actin，NPY/β-actin，ERβ /β-actin的比值表示。
1.2.8 高效液相色谱串联质谱检测神经递质GABA的释放取两组各时间点细胞样本，加入预冷的甲醇/乙腈/水，超声离心。采用Agilent 1290 Ifinity LC超高液相色谱系统进行分离，采用5500QTRAP质谱仪在负离子模式下进行质谱分析，采用Mulitiquant软件提取色谱峰面积及保留时间，进行神经递质GABA的测定。
1.3 统计学方法数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，两组比较采用LSD-t检验，多组间采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 原代培养胎鼠海马神经元的鉴定图 1A为神经元光镜图片，可见神经元之间的突起形成网状，胞体呈锥形和纺锤形，图 1B为神经元免疫荧光图片，在荧光显微镜下神经元被标记为红色，所有细胞核通过DAPI染色显示呈蓝色。在显微镜下90%以上的细胞是NF200阳性，以此证明培养的细胞是神经元。
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图 1 培养10 d海马神经元照片 Fig.1 Optical microscopy and immunofluorescence (red) images of the primary cultured hippocampal neurons (Original magnification: ×200). A: Under the light microscope (NF200-red fluorescence, DAPI-blue fluorescence); B: Under the fluorescence microscope. |
因海马神经元原代培养至4 d时生长迅速、增快，第8天时，细胞间形成致密的神经纤维网络，细胞发育成熟，故选取DBP染毒96 h，观察其形态及功能的改变，选取24、48、96 h 3个时间点探索DBP致其毒性的可能机制。
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图 2 光镜下不同浓度DBP染毒96 h后各组神经元形态变化 Fig.2 Morphological changes of the neurons under optical microscope after DBP exposure for 96 h (×100). A: 10 g/L DBP group; B: 1 g/L DBP group; C: 0.1 g/L DBP group; D: Control group. |
海马神经元原代培养4 d后将海马神经元暴露在含有终浓度为0.0（对照）、0.1、1、10 g/L DBP的培养基中，染毒96 h后光镜下可以看出10 g/L组细胞出现大量死亡，可见细胞碎片，1 g/L组细胞胞体透亮度减低，轴突纤细、轴突间网络连接稀疏，0.1 g/L组细胞形态未发生明显改变与对照组基本相同。10 g/L组光镜下虽形态改变明显，但细胞大量死亡不利于后续机制的研究，而1 g/L组细胞死亡较少，且与正常对照组相比可见较明显的异常形态改变，故选取1 g/L组作为实验组进行后续毒性作用及毒性机制的研究。
2.3 神经元形态变化 2.3.1 免疫荧光检测神经元轴突长度DBP染毒处理神经元96 h组较正常对照组神经元轴突长度变短，两组间有显著差异（P < 0.01，图 3、表 1）。
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图 3 免疫荧光检测各自神经元轴突长度 Fig.3 Immunofluorescence detection of axonal length of the neurons in each group (×200). NF200: Green fluorescence; DAPI: Blue fluorescence. A: Normal control group; B: DBP exposure group. |
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表 1 两组神经元轴突长度 Tab.1 Axonal length of neurons in the control and DBP-exposed groups (Mean±SD) |
正常组神经元核呈圆形，胞浆内线粒体粗面内质网核糖体等结构清晰（图 4A、C）；DBP染毒组细胞核呈圆形，染色有聚集，细胞质内广泛空泡形成（图 4B、D），说明DBP可对神经元的超微结构产生损伤。
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图 4 透射电子显微镜下两组神经元超微结构变化 Fig.4 Ultrastructural changes of the control and DBP-exposed neurons observed by TEM (× 12 000). A: Control group; B: DBP exposure group; C: Control group; D: DBP exposure group. Scale bar=1.0 μm. |
应用膜片钳技术记录神经元不同处理下动作电位频率情况，每组记录6个海马神经元细胞，图 5显示神经元的记录结果。于海马神经元原代培养至第4天时给药96 h后神经元放电频率4.35±0.95 Hz明显高于正常对照组神经元动作电位频率1.23±2.55 Hz（P < 0.01）。
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图 5 膜片钳记录两组神经元动作电位结果 Fig.5 Action potential (AP) of the neurons recorded by patch- clamp electrophysiology. A: Some AP records of neurons in the normal control group; B: Some AP records of neurons in the DBP exposure group. |
原代海马神经元于培养至第4天时，给予DBP染毒24、48、96 h后，与同时间点正常对照组相比细胞活性均有所减低，具有统计学差异（表 2）。
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表 2 DBP作用不同时间后海马神经元的细胞活力 Tab.2 Cell viability of neurons after exposure to DBP for different durations (Mean±SD) |
两组各时间点BDNF、NPY、ERβ蛋白结果：DBP染毒24、48、96 h ERβ蛋白表达显著低于对照组（P < 0.05），DBP染毒48、96 h后BDNF蛋白表达显著低于对照组（P < 0.05），DBP染毒48、96 h NPY蛋白表达显著低于对照组（P < 0.05，表 3）。
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表 3 DBP作用不同时间后对海马神经元DBNF、NPY、ERβ蛋白表达的影响 Tab.3 Absorbance for expressions of BDNF, NPY and ERβ proteins in the hippocampal neurons after DBP exposure for different time (Mean±SD, n=6) |
由表 4可以看出DBP染毒24 h及48 h后神经递质GABA释放有所减低，但尚无统计学差异（P>0.05），染毒96 h后GABA的释放较对照组明显降低，且具有统计学差异（P < 0.05）。
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表 4 DBP作用不同时间后海马神经元神经递质GABA表达量 Tab.4 GABA release from the hippocampal neurons after DBP exposure for different time (Mean±SD) |
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图 6 DBP作用不同时间后对海马神经元BDNF、NPY、ERβ蛋白的表达 Fig.6 Expressions of BDNF, NPY and ERβ proteins in the hippocampal neurons after DBP exposure for different time. Ctl1: 24 h Control group; DBP1: DBP exposure for 24 h group; Ctl2: 48 h Control group; DBP2: DBP exposure for 48 h group; Ctl3: 96 h Control group; DBP3: DBP exposure for 96 h group. |
DBP作为一种常见的邻苯二甲酸酯类增塑剂，具有胚胎发育、生殖毒性以及内分泌干扰效应，对人类和动物产生重要危害。近年来大量研究证实[4-6]DBP污染还对发育期神经系统具有毒性作用，引起认知行为异常。课题组前期研究[5]采用DBP对大鼠孕期及哺乳期灌胃染毒，建立围生期DBP暴露体内模型，发现DBP可对子鼠的认知及脑功能产生损害，但其机制尚未明确。目前认为可能与内分泌干扰作用[7]、氧化应激损伤[8]、海马区神经细胞凋亡、突触结构与功能异常有关[9]。
神经元细胞体外培养[10-12]是研究神经元生长发育、形态功能的重要模型，在研究神经病学发病机制、神经生物学、药物应用等领域有广泛作用。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，参与个体学习、记忆及情绪反应等多种功能，因此，海马神经元在高级神经功能中发挥着重要作用。本研究采用体外培养原代大鼠海马神经元作为研究模型，进一步深入研究DBP的神经毒性，并探索DBP的神经毒性机制，以期能为有效规避DBP的神经毒性提供重要的实验基础。
大量国外文献报道[13-15]，孕18 d胎鼠的神经系统还未完全分化成熟，拥有大量神经干细胞，离体取材损伤小，较新生鼠海马神经元存活率高且阳性率更高，更利于DBP体外染毒模型的建立。因此，本研究选取孕18 d胎鼠的海马神经细胞体外培养作为研究模型。
本研究于海马神经元原代培养4 d后将海马神经元暴露在含有终浓度为0（对照）、0.1、1、10 g/L DBP的培养基中，染毒96 h后光镜下可以看出10 g/L组细胞出现大量死亡，可见大量细胞碎片，1 g/L组细胞突起连接减少，可见稀疏的神经网络，0.1 g/L组细胞形态未发生明显改变与对照组基本相同。因考虑到10 g/L组光镜下细胞大量死亡不利于后期毒性机制的研究，故选取1 g/L组作为实验组进行下一步毒性作用的探索。神经元的生长包括4个期[16-17]，在4~8 d时生长迅速、增快，8 d后神经元已基本生长成熟处于平台期，故本研究于神经元培养至第4天给予DBP，选取染毒24、48、96 h 3个时间点，探索DBP对神经元发育的毒性作用。
本研究通过免疫荧光、透射电镜观察DBP对原代培养神经细胞结构的影响，并采用膜片钳观察DBP对神经细胞电活动的影响，以及通过cck-8检测DBP染毒后海马神经细胞活力的改变，从而探讨DBP对神经细胞功能的影响。
免疫荧光检测可以看出DBP染毒后可导致海马神经元突起网络稀疏，轴突长度变短。这可能是DBP作用于海马神经元，引起了海马神经元的病理性凋亡，从而导致细胞间突起连接减少，进而影响整个神经纤维网络。透射电镜下，染色有聚集，胞浆内出现空泡，可见DBP可对神经元的超微结构也造成损伤，Tanida的研究[9]及我们的前期研究均表明DBP灌胃染毒可以对海马各区神经细胞造成损害，诱导与学习记忆有关的功能障碍。结合本研究结果。我们认为DBP对海马神经元轴突及超微结构的损伤可能是DBP影响学习记忆及认知功能的结构基础。
DBP导致海马神经元轴突及超微结构的损害，是否进而导致神经元功能的损伤？神经细胞电活动及神经细胞活性是评估神经细胞功能的重要指标。因此本研究进一步通过膜片钳检查神经细胞电活动及cck-8检测神经细胞活性探讨DBP对海马神经功能的影响。因神经元原代培养至第8天时，细胞才发育趋于成熟，兴奋性才稳定，故本研究只对DBP染毒96 h组进行动作电位的测定。本研究通过膜片钳全细胞动作电位记录发现，DBP染毒后海马神经细胞放电频率较正常对照组增加。有研究发现[18-20]伤害性刺激可使大鼠脑区放电频率增加，这可能是因为神经元存在兴奋/抑制平衡，此类神经元始终接受GABA能神经元的调控，处于一种紧张性抑制之中[21]，在伤害性刺激作用时，兴奋性突触传递效能增强，抑制性突触传递效能减弱。这在神经元的生理和病理过程中起着非常重要的作用[22-23]。本研究中DBP染毒组海马神经细胞放电频率增加，我们推测这是海马神经细胞对毒物刺激的损伤性反应。同样，DBP染毒后海马神经细胞还出现了去极化漂移，表明DBP染毒后神经细胞出现了异常放电，进一步表明DBP暴露可致海马神经元功能受损。
DBP对神经元造成损伤的另外一个途径是改变神经元的活性，进而造成神经元的损伤或病理学凋亡。有研究表明DBP可能通过内分泌干扰作用、氧化应激损伤[7]、神经递质系统紊乱等产生神经毒作用，本研究通过CCK-8试剂盒检测DBP作用不同时间后原代培养海马神经元的吸光度，结果显示两组各时间点染毒组细胞活性均较对照组降低，并且随着染毒时间的增加，活性降低更明显。课题组前期研究表明DBP可导致海马神经各区细胞出现线粒体空泡化，CCK-8试剂盒的检测原理[24-25]与细胞线粒体中的脱氢酶有关，所以进一步推测DBP对海马神经元的线粒体结构造成了损伤，导致海马神经元内的线粒体数目减少，细胞线粒体中的脱氢酶也减少，从而使其活性降低，推测神经元形态及功能的改变是DBP影响学习记忆及认知功能的病理生理基础。
DBP导致了海马神经元的结构和功能损伤，但其分子机制尚不明确。DBP是一种环境雌激素，可干扰脑内雌激素信号相关通道。已知雌激素具有脑保护作用，其受体与学习记忆密切相关。雌激素与ERβ结合后，可激活位于BDNF基因上的雌激素反应元件，增强BDNF基因的表达，进而又诱导NPY表达增加[26-27]。这提示脑内可能存在ERs-BDNF-NPY的级联反应。BNDF和NPY是具有广泛的神经营养及保护作用的物质，参与海马神经元的存活、突触形成等，对情绪、学习记忆等有明显的调控作用[28-29]。γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳动物神经系统内主要的抑制性神经递质，许多研究证实，GABA参与了认知和学习记忆等生理活动[30-32]，在神经系统的发育过程中GABA可影响神经元的迁移、增殖与分化[33]，并且传统研究认为雌激素受体主要表达在GABAergic中间神经元，因此本研究从GABA参与的ERs-BDNF-NPY雌激素信号通路入手，进一步探讨DBP的神经毒性作用机制。
本课题组前期体内实验研究发现DBP围生期染毒后的21 d大鼠的ER-β表达与正常对照组比明显降低，提示DBP下调了幼年大鼠海马ER-β的表达，这与王亚民等[34]研究中发现双酚A围生期暴露抑制了ER-β的表达的结果一致。我们也发现DBP围生期染毒后，幼年大鼠海马的BDNF表达较正常对照组明显降低，提示DBP下调了海马BDNF的表达。故我们推测DBP围生期暴露主要通过降低血清睾酮水平，最终降低脑内源性雌激素合成，并抑制海马ER-β的表达，从而降低雌激素效应，继而下调了BDNF的表达，促进海马神经细胞的凋亡及抑制突触可塑性，导致学习记忆功能的下降，因此，我们推测DBP极有可能通过雌激素受体基因型途径和\或非基因型途径而发挥其毒性作用。
本研究发现DBP染毒24 h后对ERβ、BDNF、NPY蛋白的表达较对照组降低，但不具有统计学差异，这可能是因为DBP暴露时间较短，尚未对海马神经元蛋白水平的表达产生明显的影响。而染毒48 h组和96 h组蛋白水平表达较同时间点正常对照组下降，与课题组前期体内实验结果是一致的。但是Li等[35]研究发现高剂量的DBP暴露可增加雄性仔鼠海马区芳香化酶及早基因BDNF的表达，推测可能与BDNF的表达受到多种途径的调控，而这些调控作用的大小可能具有时间（仔鼠的天龄）特异性，并且体内体外DBP暴露浓度目前尚无明确的对应关系，实际上人群不可能暴露在如此高剂量的DBP，相反低剂量的DBP暴露的影响更具有现实意义，所以高浓度的DBP是否也会导致体外培养的原代海马神经元BDNF表达增加尚有待进一步的研究。我们还检测了3个时间点神经递质GABA的释放，发现DBP染毒24、48 h组GABA的释放较对照组无明显的降低，仅96 h组下降明显。表明DBP长时间染毒导致了神经递质GABA释放的减少。结合前期研究我们进一步推测，雌激素受体与NPY是共存于GABAergics神经细胞，在DBP染毒后，ERβ表达下降，雌激素信号减弱导致BDNF表达下降，低浓度的BDNF减弱了神经细胞兴奋反应及降低了NPY的表达，后续NPY的降低反馈作用于GABAergic中间神经元，致使其释放神经递质GABA减少以求增强兴奋反应，这也进一步解释了我们前期体外研究发现的DBP暴露后细胞活性降低，但是其兴奋性反而会增加。我们还发现DBP染毒24 h时ERβ、BDNF、NPY蛋白表达较对照组无明显的降低，推测可能是因为DBP染毒时间较短，此雌激素信号通路仍可保持生理平衡，这也是此时GABA释放较对照组无明显差异的原因，但是随着染毒时间的增加，生理平衡随即被打破，导致GABA参与的ERs-BDNF-NPY雌激素信号通路的破坏。
综上所述，本研究表明DBP导致了原代培养的海马神经细胞结构和功能的损伤，其神经毒性机制可能与GABA参与的ERs-BDNF-NPY雌激素信号通路受阻有关，这将有助于探索干预措施的深入研究。
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