2020, Vol. 40
2. 中山大学孙逸仙纪念医院生物样本库，广东 广州 510120;
3. 南方医科大学 药学院，广东 广州 510515;
4. 南方医科大学珠江医院泌尿外科，广东 广州 510028
2. Department of Biobank, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China;
3. College of Pharmacy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
4. Department of Urology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510028, China
肾脏为人体重要的排泄器官，肾间质纤维化（RIF）是所有慢性肾病中最常见的病理表现，为所有慢性肾脏疾病的最后阶段，最终不可避免地导致肾功能衰竭和死亡[1]。RIF的主要生物学事件是细胞外基质合成增加和大量积聚，其常由肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化（EMT）所致[2]。在RIF进程中EMT的发生、发展受到TGF-β/Smad[3]、P38MAPK[4-5]和wnt4/β-catenin[6-7]等多种细胞内信号转导通路的调控。KIF3A是驱动蛋白（KIF）2家族的一个重要成员，可调节细胞内运输，介导微管运动。有报道称在肾胚胎发育过程中，肾间充质干细胞中缺乏KIF3A导致肾单位数量减少[8]，而肾小管上皮细胞中缺乏KIF3A则导致肾囊肿形成并进展至肾衰竭[9-12]。然而KIF3A是否参与RIF及EMT未见报道。故本研究构建单侧输尿管梗阻小鼠模型（UUO小鼠）[13]，以及利用TGF-β1诱导肾小管细胞系NRK-52E转分化，在体内和体外研究KIF3A在肾纤维化发生前后的表达变化，并初步探讨KIF3A在EMT和RIF中的可能作用及机制。
1 材料和方法 1.1 细胞NRK-52E为本实验室保存，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，细胞消化用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA工作液处理。
1.2 动物3月龄SPF级C57BL/6J小鼠24只，体质量20~24 g，购于南方医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号为SYXK粤2006-0015。
1.3 主要药品TGF-β1、苏木素和伊红染液（Sigma- Aldrich）；α-SMA抗体、KIF3A抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔、山羊抗鼠（Alclonal）；GAPDH抗体（锐抗）；E-cadherin抗体（Cell Signaling Technology）；荧光相对定量PCR引物为擎科生物公司合成；mRNA反转录和Q-PCR试剂盒（Takara）；天狼星红染色试剂盒（雷根生物）；Masson染色试剂盒（南京建成）。
1.4 造模方法动物适应饲养1周后，随机分为假手术组（Sham组）、单侧输尿管梗阻手术组（UUO组），每组18只，假手术组仅剥离左侧输尿管，模型组剥离左侧输尿管后结扎2个位点。以1%戊巴比妥钠按8 mL/kg剂量麻醉小鼠，俯卧固定后在小鼠背部左侧切开约1~2 cm的切口，沿着肾脏下行找到左侧输尿管，UUO组在输尿管结扎两个位点，Sham组仅剥离输尿管，随后缝合伤口。于术后第7、14和21天分别处死每组6只小鼠，取手术侧肾脏进行后续实验。
1.5 荧光相对定量PCR检测先用Trizol法提取总RNA，随后用RT-PCR试剂盒进行逆转录，将提取的mRNA逆转录为cDNA后，进行荧光相对定量PCR检测，引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Tab.1 Sequences of the primers |
使用SDS裂解液裂解组织，提取蛋白后，用Western blot检测蛋白表达，以GAPDH为内参。样品经将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳后转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，取出用TBST漂洗干净即可进行一抗孵育；一抗于室温孵育2~4 h，取出用TBST振荡洗膜3次，每次5 min；二抗于室温孵育1 h，TBST振荡洗膜3次，每次10 min。膜稍沥干后加入化学发光试剂孵育1 min，稍沥干后利用曝光机进行曝光，图片扫描后用Image J分析软件分析每个目的条带灰度值，用目的蛋白灰度值与内参（GAPDH）灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量[14]。
1.7 肾脏组织切片染色选取4 μm肾脏组织切片，常规脱蜡水化后进行苏木精-伊红（HE）染色和天狼星红（Sirius Red, SR）染色；选取3 μm肾脏组织切片，常规脱蜡水化后进行马松（Masson）三色法染色。中性树胶封片后，在奥林巴斯显微镜（BX51）观察拍照，并分析每组小鼠肾小管间质的损伤和胶原沉积的阳性面积。
1.8 肾脏组织切片免疫组织化学染色选取3 μm肾脏组织切片，常规脱蜡水化后置于0.01 mol/L的枸盐酸缓冲液中高压修复3 min，1 h后打开高压锅，自然冷却至室温，用PBS冲洗后灭活内源性过氧化物酶，加入即用型山羊血清室温封闭1 h后，分别加兔抗鼠KIF3A抗体（1:100），室温孵育2 h后，PBS洗3遍，后加二抗（1:200）室温孵育1 h，PBS洗3遍后再用DBA显色，苏木素复染核2 min，最后用中性树胶封片，在奥林巴斯显微镜（BX51）观察拍照。用Image J软件对各组切片进行评分，软件根据阳性面积和染色强度评分，得分有4个等级，分别为4/3/2/1，高阳性为4分，阳性为3分，低阳性为2分，阴性为1分[15]。
1.9 肾脏组织切片染色半定量参考金瑞日等[16]的半定量方法，将masson染色和SR染色切片进行半定量分析，即在400倍镜下每张切片随机采集10个不重叠视野，将呈现为蓝色的纤维区域（masson染色）或红色的纤维区域（SR染色）视作阳性目标，以阳性面积与整个视野总面积的比值作为阳性纤维化面积率，取其平均值作为每例切片的阳性纤维化面积率。
1.10 TGF-β1诱导NRK-52E细胞纤维化选择指数生长期的细胞传代至12孔板，待细胞生长到密度约30%，将含10%胎牛血清的DMEM培养基换为无血清DMEM培养基，饥饿24 h，实验组加10 μg/L的TGF-β1溶液，对照组加PBS溶液，在5%血清的培养基中诱导48 h后，提取蛋白待分析。
1.11 统计学处理实验数据均用SPSS 19.0统计软件处理，用平均值±标准差表示。两组间均值比较采用两独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 肾脏组织切片染色结果HE染色可见：Sham组肾脏切片未见病理变化，肾小管完整无萎缩脱落等现象；UUO手术后7 d，肾小管萎缩，小管细胞脱落，小管管腔扩张，间质有炎症细胞浸润，随着梗阻时间的增多，以上病理症状加重。天狼星红（SR）染色和马松（Masson）三色法染色可见：假手术组肾脏小管基底膜完整，间质纤维胶原沉积不明显；UUO手术后7 d，肾小管基底膜断裂，间质胶原沉积增多，随着梗阻时间增多，基质成分增多，纤维化形成。将Masson染色和SR染色切片进行半定量分析，结果显示，随着梗阻时间延长，肾脏间质纤维化显著增多（图 1）。
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图 1 各组小鼠肾间质胶原沉积的检测 Fig.1 HE, SR and Masson staining of mouse kidney tissue showing increased renal fibrosis with the increase of the obstruction time. A: Scale bar=50 μm; B: Positive area rate of SR staining; C: Positive area rate of masson staining (Mean±SD, n=6). *P < 0.05, ***P < 0.0001 vs Sham at the same time point; #P < 0.05, ###P < 0.0001 vs UUO-7D; P < 0.05, P < 0.0001 vs UUO-14D. |
RT-PCR结果显示，与Sham组相比，UUO组术后7 d KIF3A mRNA的表达显著增高（1.00±0.03 vs 3.22± 0.87，P=0.011），21 d达到高峰（1.00±0.03 vs 4.80±0.14，P=0.0001，图 2A）。免疫组织化学染色及其评分结果显示，Sham组小鼠肾脏KIF3A蛋白主要表达于肾小管上皮细胞，UUO术后，随梗阻时间延长，肾小管上皮细胞的表达逐步增加，21 d最显著，且同时观察到在间质的显著表达（图 2B、C）。
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图 2 各组小鼠不同时间点KIF3A的表达及分布 Fig.2 Expression of KIF3A at different time points. A: Expression of KIF3A mRNA (Mean±SD, n=6). *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001 vs Sham at the same time point; #P < 0.05 vs UUO- 7D; ΔP < 0.05 vs UUO-14D; B: Expression and localization of KIF3A protein. Scale bar=50 μm; C: Score of immunochemistry. |
Western blot分析KIF3A及转分化标志相关蛋白α-SMA和E-cadherin蛋白的表达，以GAPDH为内参照。与Sham组相比，UUO组术后7 d KIF3A蛋白的表达开始增加，于21 d达到高峰；同时，术后7 d α-SMA蛋白的表达增多，其变化趋势与KIF3A蛋白一致，而E-cadherin蛋白表达变化趋势与KIF3A蛋白相反（图 3）。
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图 3 各组小鼠不同时间点肾组织KIF3A、E-cad和α-SMA蛋白的表达 Fig.3 Expression of KIF3A, E-cad and α-SMA proteins at different time points. |
Western blot检测到TGF-β1组较对照组转分化标志物α-SMA蛋白的表达显著增多（P < 0.001），E-cadherin蛋白表达减少（P < 0.0001），同时KIF3A的表达增多P < 0.001），Wnt4/β-catenin信号通路中Wnt4和β-catenin蛋白的表达增多（P < 0.0001，图 4）。
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图 4 TGF-β1诱导NRK-52E细胞转分化后相关蛋白的表达 Fig.4 Changes in protein expressions in NRK-52E cells after TGF-β1-induced transdifferentiation (Mean ± SD, n=4). *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001 vs Control group. |
肾间质纤维化（RIF）是所有慢性肾脏疾病发生发展的最后阶段[17]。RIF发生时上皮细胞-间充质转化（EMT）激活，基质蛋白合成增多而基质降解受到抑制，小管间质可见胶原和纤维连接蛋白的堆积[18-19]。本研究构建了单侧输尿管梗阻所致的RIF模型，UUO手术后7 d，小管间质增宽，胶原沉积增加，纤维形成，且随着梗阻时间延长至14、21 d时，纤维化程度逐步加重。本研究首次发现，RIF模型中，KIF3A在肾小管上皮和间质表达增多，提示KIF3A可能参与了RIF的发生。
KIF3A是异三聚体驱动蛋白2的亚基，属于N-驱动蛋白，微管正端导向的马达蛋白。异三聚体驱动蛋白2由KIF3A、KIF3B两个亚基和运载蛋白KAP3组成[20]。有研究报道KIF3A在细胞增殖和迁移中发挥着重要的作用，在上皮细胞过度表达可促使细胞转分化[21]。本研究发现UUO手术后，小鼠肾脏KIF3A的表达增加，E-cadherin蛋白下降，α-SMA蛋白表达增高，体外利用TGF-β诱导肾小管细胞系NRK-52E转分化时也发现KIF3A蛋白的表达增加，E-cadherin蛋白下降，α-SMA蛋白表达增高。α-SMA是成纤维细胞的标记物，其为ECM的主要来源[22]。因此我们推测，KIF3A可能参与EMT，进而加重RIF。
研究报道KIF3A参与wnt/β-catenin信号通路的调节，后者在细胞的增殖和凋亡发挥重要的作用[23]。以往多项研究表明，wnt/β-catenin信号通路为肾纤维化疾病发生发展中的经典信号通路[24]，对于正确的肾单位发育至关重要，并且在受损的肾小管上皮细胞中被重新激活，特别是在损伤后重新填充小管的增殖的管状祖细胞中[25]。而RIF的主要原因为上皮细胞-间充质转化（EMT）激活，后者被多项研究证明[26-28]能被wnt/β-catenin信号通路所激活。具体作用机制为：Wnt信号通路能通过抑制糖原合成酶激酶3β介导的磷酸化作用和细胞质中β-catenin蛋白降解作用等来诱发EMT的发生[29]。细胞内较大浓度的β-catenin蛋白会转移进入核内，作为转录因子亚单位诱导大量基因的表达，后者的表达产物中有大部分是诱导EMT转换发生的转录因子。本研究中，利用TGF-β1诱导NRK-52E细胞转分化后，KIF3A蛋白的表达增多，同时wnt4和β-catenin蛋白的表达增多，因此，我们推测：KIF3A是否可通过激活wnt/β-catenin信号通路从而诱发上皮细胞-间充质转化，从而加重RIF？还需要进一步的实验证实。
综上所述，本文通过构建单侧输尿管梗阻的UUO和体外诱导肾小管细胞系NRK52-E纤维化，首次发现在纤维化发生时，KIF3A的表达显著增加。且伴随着转分化相关蛋白α-SMA蛋白的表达显著增多，E-cadherin蛋白表达减少。同时wnt/β-catenin信号通路被激活。我们推测，KIF3A有可能通过激活wnt/β-catenin信号通路，参与EMT及RIF。然而，这些只是初步的实验现象，深入的作用及其机制还需要进一步的实验研究。
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