2020, Vol. 40
自2019年12月8日起，在中国武汉爆发了以呼吸道为主要症状的肺炎，经二代测序、病毒分离和鉴定等手段，确定为一种新型的冠状病毒[1-2]，世界卫生组织于2020年1月19日将其暂命名为2019新型冠状病毒(2019 Novel Coronavrius, 2019 nCoV)[3]，于2020年2月11日正式命名为SARS-CoV-2病毒，引起的疾病称为2019冠状病毒病(COVID-19)[4]。至2020年2月13日，中国新型冠状病毒肺炎确诊59 895例，疑似病例16 067例，死亡1367例；中国以外492例，波及日本、泰国等24个国家[5]；随着诊断试剂的足量应用和疫情的进展，确诊病例数量可能更进一步增加，严重威胁到人们的生活和生命健康[6]。因此，在2020年1月30日，世界卫生组织突发事件委员会经过讨论决定：将此次新型冠状病毒感染疫情确认为“国际关注的突发公共卫生事件”[7]，以保护其他国家，尤其是为了保护一些医疗系统比较脆弱的国家，以便这些国家对此肺炎疫情进行更好的预防和控制。该病成为2009年H1N1、2014年脊髓灰质炎、2014年埃博拉、2016年寨卡、2019年埃博拉疫情之后[8]，第6起国际关注的突发公共卫生事件。由此可见，此次新型冠状病毒疫情的严重性。
在疫情的进行中，中国的科学家对病毒特征、疾病的特征进行了很好的解析和描述[9-10]，为疾病的防控打下了坚实的基础。病毒的溯源，推测是由蝙蝠作为病毒库传播而来[11]，至于有无中间宿主、中间可能的宿主是什么还待于进一步研究确定。在病毒疫情进行中，有一项重要的研究内容是：病毒进化过程起源时间，疫情进展中病毒的变异情况如何；这个内容对病毒疫情防控也具有重要的意义。本文根据GISAID中提交的序列(截止到2020年1月29日)分析病毒进化的相关情况。
1 材料和方法 1.1 病毒株序列从https://www.gisaid.org/上下载关于SARS-CoV-2序列，共计45条全长基因组序列。其中39条序列用于病毒最近共同祖先时间的计算(tMRCA)。其它冠状病毒序列从NCBI序列数据库中下载。
1.2 进化树构建、序列相似性分析软件MEGA-X下载于https://www.megasoftware.net/；tMRCA相关分析软件组合BEAUti、BEAST、TreeAnnotator下载于http://www.beast2.org/, 从http://tree.bio.ed.ac.uk/software/下载进化树数据显示软件Tracer v1.6、进化树显示软件FigTree、进化分子钟检测软件TempEst。
1.3 进化树构建方法将序列导入MEGA-X中，应用软件找到最佳核苷酸替代模型参数，并应用此参数构建进化树和tMRCA的计算，进化树的可靠性检验采用自展法(Bootstrap= 1000次重复)；病毒采样时间导入BEAUti中，以2020年1月23日作为0时间，以天为单位，以病毒株BetaCoV/ Wuhan/IPBCAMS-WH-02/2019|EPI_ISL_403931作为局外群(outgroup，树根)，进行推算tMRCA。
2 结果 2.1 基因组序列基本信息病毒序列用二代测序或结合三代测序测定，测序长度为29 688~29 899 bp之间[12]，全部涵盖了病毒的编码区。病毒编码的结构蛋白S、E、M和N蛋白，非结构蛋白ORF1a、ORF1ab、ORF3等在文献和数据库中有详细的解析[13-14]。
39株SARS-CoV-2全长基因组核苷酸序列经比对后，与SARS冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征(MERS CoV)的序列相似性分别平均为78.7%和48.7%，与来自于蝙蝠冠状病毒株bat-SL-CoVZC45 (简写CoVZC45)和bat-SL-CoVZXC21 (简写CoVZXC21)较为接近，相似性为87.5%和87.3%，与BetaCoV/bat/ Yunnan/RaTG13/2013 (简写RaTG13)最为接近，相似性为95.9%。其他冠状病毒之间差异较大，在48.0%~ 87.4%之间，也决定了它们在进化上分属于不同的病毒属(表 1)。
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表 1 39株SARS-CoV-2病毒与其他冠状病毒核苷酸的相似性比较 Tab.1 Comparison of nucleotide similarities between 39 SARS-CoV-2 isolates and other coronaviruses (%) |
各冠状病毒编码蛋白质ORF1ab、S、E、M和N的氨基酸相似性性如表 2~6所示。选用序列MN908947作为参考株进行比较，结果与基因组的核苷酸相似性一致。ORF1ab、S、M和N蛋白与RaTG13、CoVZC45、CoVZXC21相似性最高，其次是SARS-CoV，与MERS CoV相似最低，结合后面进化树分析的结果，在同一亚属内有着高的相似性，不同亚属之间的相似性较低。值得注意的是E蛋白高度保守，SARS-CoV-2与RaTG13、CoVZC45、CoVZXC21完全一致，与SARS-CoV仅有4个氨基酸的差别。
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表 2 冠状病毒ORF1ab的氨基酸相似性 Tab.2 Amino acid similarities of ORF1ab among different coronaviruses (%) |
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表 3 冠状病毒S蛋白的氨基酸相似性 Tab.3 Amino acid similarities of the S protein among different coronaviruses (%) |
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表 4 冠状病毒E蛋白的氨基酸相似性 Tab.4 Amino acid similarities of the E protein among different coronaviruses (%) |
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表 5 冠状病毒M蛋白的氨基酸相似性 Tab.5 Amino acid similarities of the M protein among different coronaviruses (%) |
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表 6 冠状病毒N蛋白的氨基酸相似性 Tab.6 Amino acid similarities of the N protein among different coronaviruses (%) |
应用MEGA-X软件寻找最佳核苷酸替代模型模块，以BIC (Bayesian Information Criterion)最小值为最佳核苷酸替代模型参数，显示TN93模型为最优。以TN93替代模型、NJ (Neighbor joint)法构建全基因组进化树，结果如下图 1A所示。根据国际病毒分类委员会的分类，目前冠状病毒的分类是Alpha、Beta、Gamma和Delta[15]。从图 1中，我们可以看到SARS-CoV-2与BetaCoV/bat/Yunnan/RaTG13/2013、bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21形成了sarbecovirus属的一个分支，而SARS-CoV等病毒构成了sarbecovirus属的另一个分支。
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图 1 SARS-CoV-2的全基因组进化分析 Fig.1 Phylogenetic analysis of the full-length genome of SRAS-CoV-2. A: Whole genome evolutionary tree of SARS-CoV-2 virus strains(compressed in triangle); B: Unfolded evolutionary tree of 38 isolates of SARS-CoV-2 virus. |
应用MEGA-X软件构建进化树，导入进化时间信号分析软件TempEst中，分析是否具有进化上的时间信息。如图 2A所示，显示有微弱正向进化信号，粗估时钟速率是2.24×10-6substitution/site/day，tMRCA为-131 d，R2=0.08。在此基础上，我们应用BEAST软件进行精细评估tMRCA。如图 2B所示，tMRCA平均时间是73.0 d (2019年11月10日)，95%可信区间是38.9~119.3 d，后验概率是100%。结果提示病毒的出现日期在2019年9月23日~2019年12月15日之间。这与文献中报道的第1例病例在2019年12月1日出现也是相吻合的。
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图 2 SARS-CoV-2病毒的tMRCA计算 Fig.2 tMRCA of SARS-CoV-2. A: Calculation of evolutionary time signals of SARS-CoV-2 virus. The point indicates the genetic distance of each isolate of the virus from the reference strain (outgroup, tree root) on the time scale; B: Analysis of tMRCA of SARSCoV-2 virus using BEAST. |
应用进化时间信号分析软件TempEst检测SARSCoV- 2与BetaCoV/bat/Yunnan/RaTG13/2013、bat- SL-CoVZC45、SARS-CoV之间是否有进化上的时间关系。结果显示：SARS-CoV-2与BetaCoV/bat/Yunnan/ RaTG13/2013不存在时间进化关系，斜率为-1.8×10- 5 substitution/site/day，R2=0.998 (图 3A)，说明在自然界自然进化中是很难实现的，然而与CoVZC45、SARS-CoV确存在着明显的正性时间进化信号(图 3B、C)。
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图 3 SARS-CoV-2病毒与其他冠状病毒进化时间信号检测 Fig.3 Temporal signal test of molecular phylogenies of SARS-CoV-2 together with other coronaviruses. A, B, and C: Evolution time signal detection results of SARS-CoV-2 virus strain and RaTG13, CoVZC45, and SARS-CoV viruses, respectively. |
我们将38株序列进行比较，核苷酸之间变化差异非常小，以最早测定的序列BetaCoV/Wuhan/ IPBCAMS- WH- 01/2019|EPI_ISL_402123为参考序列，共计有117处变异，如图 4所示，变异位点没有聚集性，相对均匀地分布整个基因组。从中也可以看出，有3个位点的变异(发生在ORF1ab上)，稳定地表达在其它36株病毒中，同时有多个位点在病毒株序列中聚集。
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图 4 38株病毒序列变异 Fig.4 Variation of 38 SARS-CoV-2 strains. Each green vertical line represents the the location of variation in the genome, using the earliest BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-01/2019|EPI_ISL_402123 20191224 as the reference sequence. |
我们将变异序列导入http://www.datamonkey.org/中，分析其变异是否存在选择压力。如表 7所示，参与病毒复制相关蛋白有48处变异位点，采用固定效应似然比检验模型(FEL)发现有4处存在净化选择，而采用相对保守的方法单一似然祖先计数(SLAC)法只能检出一个位点。在S蛋白、M蛋白和N蛋白中只能用FEL法检出具有统计学意义的2~3种净化选择，在N蛋白中检出1种正向选择进化。
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表 7 SARS-CoV-2病毒主要蛋白的选择进化压力分析 Tab.7 Analysis of selection pressure of the main proteins of SARS-CoV-2 |
自2019年12月初起，从武汉流行的新现的冠状病毒[8]，至2020年2月，引发了至目前为止全中国6万人的感染，病死人数1100余人，对人们健康危害已经远超2003年前后的SARS流行[16-17]。该病毒由于与SARSCoV病毒有较高的相似性，与SARS-CoV同属于β冠状病毒属的Sarbecovirus亚属(图 1)，以及对人们的健康产生严重影响，国际病毒命名委员会将其命名为SARSCoV-2，与SARS-CoV是姊妹病毒[18-19]。世界卫生组织将该病毒引起的疾病称为COVID-19。这也是目前发现第7种能使人致病的冠状病毒[20]。
该病毒具有比SARS-CoV更强的传播力、更长的潜伏期，这是病毒广泛感染人的基础[21-22]。尽管病毒的基因组在疾病流行期间很快被解析[2]，有多篇文献报道了其基因组特征[23-24]，但这些特征还难以解释病毒的强传播力[8]。影响病毒播散的另外一些重要因素是病毒的溯源，包括：病毒出现的时间，是否有中间宿主，传染源是什么，以及传染源是否一直存在。科学家根据现存数据库中病毒序列信息，以及当前的溯源研究，推测是来源于菊头蝙蝠[25]。
关于病毒出现的可能时间，我们应用进化分析软件TempEst分析当前基因组数据，结果提示已经出现了分子钟事件信号，这是后面进行tMRCA计算前提。在此基础上，我们应用BEAST软件推算病毒可能出现的时间为38.9~119.3 d (从1月23日往前推)，也就是在2019年9月23日~2019年12月15日之间。这也提示目前武汉市高感染原因之一。我们注意到，本文中关于tMRCA的推算因为时间跨度太短(只有30 d)，可能结果并不是很准确，但也提供了一定的信息。
关于病毒的来源，目前与SARS-CoV-2相似性比较高从蝙蝠中分离到的病毒是RaTG13 (云南，2013年)、bat- SL- CoVZC45和bat- SL- CoVZXC21(2017年，浙江)，其中相似性最高的是RaTG13病毒株。如果SARS-CoV-2是来自于RaTG13病毒株，那么RaTG13病毒就应与SARS-CoV-2具有时间进化信号。我们检测了两种病毒时间进化上的信息，发现呈负相关(进化速率是负的)(图 3A)；如果SARS-CoV-2演化于RaTG13病毒，应该是正性进化速率，因此我们推测：SARS-CoV-2来源于RaTG13病毒的可能性不大，尽管它们之间有较高的相似性。我们随后演算了SARS-CoV-2与bat-SLCoVZC45和SARS-CoV之间的进化关系，发现它们具有很明显的正性相关关系(图 3B、C)。提示SARS-CoV-2的产生与bat-SL-CoVZC45等冠状病毒有一定的关系。这一点仍需更多的实验进行支持。
病毒在流行过程中，是否产生对抗外界压力的适应力，也是影响病毒传播能力一个重要因素[26]，从临床的数据显示，病毒的传播确是不断增加[27]。我们通过全基因组数据选择进化压力分析，结果显示病毒表现一种进化选择，在高度保守的基因内，发生多频次的同义替代，这种替代远高于非同义替代，这些替代的位置可能对病毒的生命活力具有重要的影响。继续加强这些位点的监测，将有助于解析SARS-CoV-2强传播能力，对后期的防控具有一定的指导作用。
致谢: 衷心感谢众多研究者将研究数据提交到GISAID中，为本文奠定了基础!| [1] |
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