2019, Vol. 39
2. 南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心，广东 广州 510515
2. Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
畸精子症是指精子形态的异常，即精子的畸形率增高，而精子的形态异常往往影响精子与卵母细胞透明带的结合，致使受精率降低，严重降低男性生育能力，影响体外受精（IVF）结局[1]。虽然畸精子症的临床治疗包括药物和辅助生殖技术，但存在费用高、妊娠率低等问题。就其根本原因在于畸精子症的发生机制尚不清楚，难以从根本上解决此类患者的生育问题。据报道，全世界育龄夫妇不孕不育症的发病率在8%~15%，其中20% ~30%完全由男性因素造成的[2]，且男性生育能力呈逐年下降趋势[3-4]。因此，寻找畸精子症发生的相关因素，对于揭示其发病机理，提高此类患者的生育能力极为重要。氧化应激可产生活性氧（ROS），一定水平的ROS对于维持男性生殖系统正常生理功能具有重要意义，而过高的ROS水平与精子的畸形率上升密切相关[5-8]。以往的研究主要关注ROS介导的脂质过氧化和DNA氧化损伤对精子畸形率及其IVF结局的影响[9-10]，而蛋白质的氧化损伤往往被忽视。近年来，发现晚期氧化蛋白产物（AOPPs）不仅是体内蛋白质氧化的终末期产物，而且可作为内源性致病物质，诱导或加重氧化应激[11-12]，是机体许多慢性疾病如肾病、心血管、内分泌等疾病发生的重要机制[13]。AOPPs可引起中性粒细胞及单核细胞呼吸爆发；刺激中性粒细胞合成IL-8；刺激单核细胞合成炎性细胞因子TNF- a；刺激血管内皮细胞产生ROS。AOPPs检测技术简单、快速、低廉，且在评价氧化应激的特异性、灵敏度等方面均优于目前常用的经典检测指标ROS、SOD等，故AOPPs被认为是一种新型的、可靠、实用性强的蛋白氧化应激指标[14]。研究发现无精子症组精浆中AOPPs浓度显著高于正常男性组[15]。但是，关于AOPPs对畸精子症严重程度及IVF结局的影响，目前尚未见报道。因此本研究旨在从蛋白氧化损伤角度，探讨精浆中AOPPs水平与畸精子症严重程度及IVF结局参数的关系。
1 资料和方法 1.1 研究对象采用两阶段横断面调查研究，选取了2018年10月~2019年3月在南方医科大学南方医院生殖医学中心接受不孕不育治疗的272对夫妇为研究对象。第1阶段实验旨在探索精浆AOPPs与精液参数的相关性，选取86对不孕不育夫妇的助孕前男方精浆标本，年龄26~50岁，34.8±5.5岁；第2阶段实验旨在进一步探究精浆AOPPs与体外受精结局参数的关系，选取186对不孕不育夫妇的取卵日男方精浆标本，年龄23~50岁，35.3±5.9岁。纳入标准：超促排卵方案：拮抗剂或降调节方案；获卵数≥5个；行IVF受精。排除标准：男性吸烟、癌症、泌尿生殖道和腺体感染。所有受试者纳入本研究前均获得知情同意。伦理审查由南方医院伦理委员会批准。
1.2 分组按照精子正常形态百分比将受试分为2组，1%~ 3%为A组（畸精子症组），≥4%为B组（正常精子形态组）；畸精子症组又分为3个亚组，1%为a组（重度畸精子症），2%为b组（中度畸精子症），3%为c组（轻度畸精子症）。按照受精率中位数83%（71%，94%）分为两组，≤83%为Ⅰ组（低于中位数组），> 83%为Ⅱ组（高于中位数组）。
1.3 标本收集和处理所有受试对象禁欲3~7 d后以手淫法采集精液标本，置洁净、经消毒的一次性塑料容器内，室温下精液液化。在第1阶段实验中，按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》标准[16]，对助孕前精液标本进行精液常规分析，测定精液体积、精子浓度，精子活力以及正常精子形态百分比等指标。精液分析后，将所有精浆样品以300 g离心15 min，置于15 mL锥形离心管中，取上清液储存在-80 ℃冰箱。在第2阶段实验中，将取卵日精液标本进行常规离心处理后，取上清液储存在-80 ℃冰箱。
1.4 AOPPs和ROS的测定AOPPs测定采用ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）。本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人AOPPs水平，用酶标仪测定吸光度（A450 nm），通过标准曲线计算样品中人AOPPs浓度。质控、测定曲线及操作均严格按照说明书进行。ROS测定采用化学荧光法测试盒（Sigma）。利用DCFH-DA（2, 7-dichlorofuorescin diacetate）作为细胞内活性氧检测探针，将激发波长设置为500 nm，发射波长设置为525 nm，荧光分光光度计（Perkin Elmer）进行荧光检测。具体操作均按照说明书进行。
1.5 观察指标年龄、体质量指数（BMI）、受精率、异常受精率及良好胚胎形成率。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间采用两样t检验，多组间采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。计数资料以（%）表示，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用Pearson相关和偏相关分析，以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 精浆中AOPPs水平与精液参数的相关性分析第1阶段实验选取的86例男方精液标本，结果显示精浆中AOPPs与ROS水平呈正相关（r=0.277，P=0.01），与正常精子形态百分比呈显著负相关（r=-0.315，P= 0.003），而与年龄、BMI、禁欲天数、精液体积、精液PH、精子浓度、非前向精子运动百分率（NP）、前向精子运动精子百分率（PR）、精子活力、正常精子形态百分比等指标无显著相关性（P > 0.05）。精浆中ROS水平与正常精子形态百分比（r=-0.268，P=0.013）、精子活力（r=-0.269，P=0.012）及PR（r=-0.297，P=0.005）均呈负相关（表 1）。
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表 1 精浆中AOPPs水平与精液参数的相关性分析 Tab.1 Correlation between the levels of seminal AOPPs and sperm parameters |
为进一步验证精浆AOPPs与精子形态的关系，我们按照精子正常形态百分比分为2组，1%~3%为A组（畸精子症组），≥4%为B组（正常精子形态组）。结果显示：与正常精子形态组相比，畸精子症组精子浓度（P= 0.003）、PR（P=0.000）及精子活力（P=0.000）均显著降低，精浆AOPPs（P=0.027）和ROS（P=0.047）水平均显著升高（表 2）。
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表 2 不同精子形态组中患者的一般资料比较 Tab.2 Comparison of basic parameters in different sperm morphology groups |
为进一步探索精浆AOPPs与畸精子症严重程度的关系，我们按照精子正常形态百分比，将畸精子症组又分为3个亚组，1%为a组(重度畸精子症)，2%为b组(中度畸精子症)，3%为c组(轻度畸精子症)。单因素方差分析结果显示：3组精浆中AOPPs（F=3.635，P=0.033）水平存在显著性差异。两两比较结果显示：在重度畸精子症组，精浆AOPPs水平显著高于轻度（P=0.019）和中度畸精子症组（P=0.015，图 1A）。3组精浆中ROS水平虽无显著性差异，但随着畸精子症严重程度的增加，出现了升高的趋势（图 1B）。
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图 1 不同严重程度畸精子症组精浆中AOPPs和ROS水平的差异 Fig.1 Seminal levels of AOPPs (A) and ROS (B) in teratospermia groups with different severities (*P < 0.05). a: 1% of normal sperm; b: 2% of normal sperm; c: 3% of normal sperm |
为了研究精浆AOPPs对IVF结局的影响，在第2阶段实验中我们选取了186例接受IVF治疗的取卵日男方精液标本，按照受精率中位数83%（71%，94%）分为2组，≤83%为Ⅰ组（低于中位数组），> 83%为Ⅱ组（高于中位数组）。结果显示：与高于中位数组相比，低于中位数组取卵日精浆AOPPs（P=0.036）和ROS（P=0.049）水平显著升高，成熟卵母细胞率显著降低（P=0.000，表 3）。
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表 3 不同受精率组中患者的一般资料比较 Tab.3 Comparison of basic parameters in different fertilization rate groups |
我们分析了186例取卵日男方精浆中AOPPs水平与IVF结局参数的相关性，结果显示取卵日精浆中AOPPs水平与受精率呈显著负相关（r=- 0.214，P= 0.003），与异常受精率（r=-0.096，P=0.190）及优质胚胎形成率（r=0.027，P=0.710）无相关性。此外，我们控制了成熟卵母细胞率这一变量对受精率的影响，采用偏相关分析结果显示取卵日精浆中AOPPs水平仍与受精率呈显著负相关（r=-0.228，P=0.002）。精浆中ROS水平与IVF结局参数的相关性与AOPPs结果一致（表 4）。
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表 4 精浆中AOPPs水平与IVF结局参数的相关性分析 Tab.4 Relationship between seminal AOPPs level and IVF outcome parameters |
氧化应激是指机体内ROS的产生和清除处于失衡的一种状态[17]。生理剂量的ROS在调节细胞生长、信号传导及防御微生物侵袭等方面都有着重要作用。生理状态下，精子能够自发产生一定量的ROS，适量的ROS在调控与精子获能相关的酪氨酸磷酸化反应中扮演着重要的角色。然而，当精子内ROS水平远远超过抗氧化剂所能承受的最大限度，则会诱发一系列的氧化应激反应，导致脂质过氧化、蛋白质修饰和DNA损伤[18]。研究表明[19-21]，精浆中异常升高的ROS水平与男性不育密切相关。
AOPPs不仅是氧化应激的产物，同时也是氧化应激的执行者，可进一步促进氧化应激的产生，形成氧化应激的恶性循环[11-12]。而过度的氧化应激可损害精子形成和精子代谢，增加精子畸形率，继而降低受精率，最终致男性不育[22-23]。然而AOPPs是否与畸精子症严重程度及其IVF受精率低下相关，尚不清楚。本研究结果显示，与正常精子形态的男性相比，在畸精子症尤其是重度畸精子症患者的精浆中AOPPs水平显著升高，同时相关分析发现AOPPs与正常精子形态百分比及其IVF受精率呈显著负相关关系。
在第1阶段助孕前精浆的研究中，通过对AOPPs水平与各项精液参数的相关性分析，我们发现了AOPPs与正常精子形态百分比存在负相关。继而根据正常精子形态百分比进行分组比较，结果发现与正常形态精子组比较，畸精子症组精浆AOPPs水平显著升高，尤其重度畸精子症组显著高于轻、中度组。提示精浆中AOPPs水平的异常升高，可能预示着男性发生重度畸精子症的风险增高。Kratz等[15]在前期研究中发现无精子症组和畸形精子症组的AOPPs水平高于正常对照组，无精子症患者的精浆中AOPPs水平高于畸形精子症组，该研究认为精浆中过高的AOPPs水平可能影响了精子的正常发育。这与我们的结果一致，我们的结果不仅发现畸形精子症组中的AOPPs高于正常形态组，且随着畸形程度的加重，精浆AOPPs水平也是逐渐升高。氧化应激造成精子结构和功能完整性的损害，是导致精子细胞功能障碍和男性不育的主要原因[23]。抗氧化剂对致畸精子具有保护作用，能提高精子活力和DNA完整性，这进一步证实了氧化应激反应对精子产生的重大影响[24]。本研究中，虽然不同程度畸精子症组精浆中ROS水平无显著性差异，但随着畸精子症严重程度的增加，ROS水平呈现了升高的趋势，同时精浆中ROS水平与正常精子形态百分比存在负相关，而AOPPs与ROS呈显著正相关。过量的ROS水平主要介导脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤[18]，而AOPPs作为蛋白质氧化损伤的产物，可引起ROS的蓄积。故我们推测，AOPPs作为内源性致病物，可诱导和加重机体内氧化应激反应，致使过量ROS产生，并进而对精子的形态和功能造成损伤。
既然精浆中AOPPs水平与畸精子症及其严重程度相关，而畸精子症影响IVF受精，因此在第2阶段取卵日精浆的研究中，我们进一步分析了AOPPs水平与IVF受精率的关系。根据受精率中位数进行分组比较，发现低于受精率中位数组精浆AOPPs水平显著升高，采用Pearson相关分析也发现AOPPs水平与IVF受精率负相关。考虑受精率与女方因素也存在一定的相关性，为了剔除女性相关因素的影响，我们也比较了不同受精率组中女方年龄、不孕类型、不孕原因、不孕年限及成熟卵母细胞率等指标，结果发现低受精率组成熟卵母细胞率显著降低，其余指标均无显著差异。因此，我们控制了成熟卵母细胞率这一变量后，AOPPs水平仍与受精率呈负相关。提示精浆中过高的AOPPs水平可能影响IVF受精率。虽然目前精浆中AOPPs与IVF结局的相关报道较少，但是过度的氧化应激对男性生殖损害的报道较多，如毒物暴露、化疗、电离辐射、衰老、肥胖、吸烟和酗酒等都会造成男性生殖系统过度的氧化应激反应，而其均会对男性生殖道、生殖细胞、性激素、子代的表观遗传等方面造成严重的负面影响[25]。多项研究表明过高的ROS可以与精子DNA反应，造成N-糖苷键断裂，使DNA脱碱基位点，影响分子结构稳定性，导致DNA单链断裂，最终损伤DNA[26-29]。ROS水平与精子异常形态发生率之间存在显著的正相关[23, 30-31]。精子DNA碎片指数与IVF受精率呈显著负相关[32-33]。而Hammadeh等[34]发现精浆中过高的ROS水平与IVF周期受精率降低有关。我们的结果中同样证实了ROS与受精率呈负相关。因此，我们推测精浆中过高的AOPPs水平，可能通过诱导或加重氧化应激，使ROS异常升高。而异常升高的ROS，一方面损伤精子DNA，使精子DNA链断裂[28]；另一方面使精子膜发生脂质过氧化，破坏膜的流动性和完整性，增加畸形率[35-36]，进而导致受精率下降，最终影响IVF结局。
综述所述，精浆中AOPPs水平与畸精子症及其严重程度相关，过高的AOPPs水平可能影响IVF受精率。提示精浆中AOPPs水平的异常升高可能预示着男性发生重度畸精子症及IVF受精率低下的风险增高。这为探索畸精子症发病机理和寻找干预措施提供新思路。同时有望通过补充抗氧化剂或NADPH氧化酶抑制剂减轻或降低精浆氧化应激水平[28]，改善精液质量，增加受精率，提高此类患者生育能力和辅助生殖技术治疗效率。
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