非小细胞肺癌在肺癌中约占80%，发病率逐年上升^[1]，多数患者在确诊时已处于肺癌晚期，且伴有局部或远隔脏器转移，因此非小细胞肺癌的首选治疗方式仍为化疗^[2-3]。肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因^[4-5]，而SRC酪氨酸激酶与肿瘤细胞的生长、转移、细胞信号传导、血管的新生密切相关，已被公认为是重要的抗肿瘤作用靶点^[6-8]。肿瘤细胞的转移受多种因素影响，为肿瘤治疗的研究热点^[14-16]。有研究表明，SRC激酶的活化状态与缝隙连接蛋白（Cx）的表达相关，SRC激酶可以通过磷酸化Cx43，调控细胞缝隙连接功能^[9-11]。抑制SRC激酶可以抑制肺癌细胞的增殖^[12]，其抑制剂PP2可以抑制癌细胞的迁移侵袭^[13]。但PP2能否影响肺癌细胞A549侵袭转移能力及其相关机制尚未可知。因此，本研究重点观察SRC激酶抑制剂PP2对肺癌细胞A549侵袭转移能力的影响，并进一步探讨其机制，为临床化疗中靶向抑制肿瘤转移提供治疗新方向。

肺癌细胞株A549蚌埠医学院药理实验室冻存。SRC激酶抑制剂PP2（Sigma），噻唑蓝（MTT）（Sigma），二甲基亚砜（Sigma），胰酶（Sigma）；RPMI培养基（Gibco）；胎牛血清（四季青公司）；Cx43过表达质粒（mCx43）、SiRNA由上海吉玛基因设计合成；Cx43抗体，MMP-2抗体（Sigma），GAPDH单克隆抗体（Proteintech），Goat Anti-Mouse IgG（Proteintech），Goat Anti-Rabbit IgG抗体（Proteintech），蛋白Marker（Thermo）。

肺癌细胞A549培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI培养基内，置于5% CO₂、37 ℃及饱和湿度的细胞培养箱中传代培养，传代时使用0.25%的胰酶细胞消化液处理，传代比例约为1:2。

取生长状态良好的A549肺癌细胞，计数后按照5×10⁴/mL的密度接种至96孔板，每孔加入细胞悬液200 µL，于培养箱内培养24 h，加入不同浓度药物PP2 [终浓度依次为1、4、8、16、32 µmol/L，每组设置6个平行复孔，并设置阴性对照组（不加药，含有正常状态的细胞）]，药物分别处理24、36、48 h后，每孔内加入20 µL、浓度为5 g/L的MTT，培养箱中继续培养4 h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200 µL，继续于37 ℃培养箱中放置30 min使DMSO与细胞内物质充分接触反应后测定A_490nm，并计算细胞存活率。

取生长状态良好的肺癌细胞A549，计数后按照4~5×10⁵/mL的密度接种于六孔板内，每孔加入细胞悬液2 mL，置于培养箱中继续培养，使细胞24 h内融合度达到70%~90%；SiRNA（或过表达质粒）和Lipofectamin2000各5 µL，分别与50 µL无血清Opti-MEM混合，轻柔混匀，室温放置5 min，将稀释好的SiRNA（或过表达质粒）和Lipofectamin2000试剂混合，轻柔混匀，室温放置20 min，以便形成SiRNA（或过表达质粒）/Lipofectamin2000复合物，孔板内细胞用PBS清洗2次后加入无血清RPMI培养基，再将形成的复合物加入到含细胞和培养基的培养孔板中，来回轻柔摇晃细胞培养板，细胞在5% CO₂、37 ℃及饱和湿度的细胞培养箱中继续培养12 h后更换为含有10%胎牛血清的RPMI，继续培养至24 h，进行转染后其他操作。

SRC激酶抑制剂PP2（终浓度依次为0、1、2、4、8、16 µmol/L）、过表达质粒和SiRNA，分别作用于细胞24 h后，消化并收集细胞，加入裂解液于冰上裂解30 min，后在四度离心机12 000 r/min离心30 min，收集上清液，BCA蛋白定量法（参照试剂盒说明书操作）测各组蛋白浓度，用细胞裂解液将各组蛋白稀释至相同浓度，与一定量5×上样缓冲液4:1混合，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。经SDS-PAGE电泳（10%分离胶）分离后电转印至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h；Cx43一抗（1:2000稀释，使用一抗稀释液稀释）4 ℃孵育过夜；取出用TPBS洗涤3次，10 min/次；Goat Anti-Mouse IgG（1:5000稀释，使用TPBS稀释）室温孵育2 h；TPBS洗涤3次，10 min/次，ECL发光试剂盒显影曝光。BioRad凝胶成像系统采集图像。以GAPDH为内参对照，蛋白表达强度以Cx43、MMP-2蛋白表达灰度值与GAPDH灰度值的比值表示。

取生长状态良好的肺癌细胞A549，酶解计数后按照5×10⁵/mL接种至六孔板内，每孔加入细胞悬液2 mL；继续培养24 h，使细胞融合度达到90%以上，弃原孔板内上清液，使用PBS清洗2遍，用200 µL移液枪枪头在孔板内划竖向垂直于培养板的“一”字痕，用PBS清洗3遍，洗去上清液中不贴壁的细胞，不同孔内加入不同浓度的用不含血清的RPMI培养基配制的SRC激酶抑制剂PP2（药物浓度为0、1、2、4、8、16 µmol/L）2 mL，放入培养箱内继续培养，分别取药物作用0、12、24 h，置于倒置显微镜下拍照（100×），每孔拍6张照片，对比不同药物浓度、不同作用时间的细胞转移情况，采用ImageJ2x统计划痕愈合面积，使伤口愈合面积标准化，即实验处理组与对照组相比得到创伤愈合百分比，进行统计学分析。

预先在上室平铺50 µL的Matrigel胶（基质胶与无血清培养基1:4混合），在37 ℃培养箱内聚合4 h；取对数生长期的细胞A549，胰酶消化为单个细胞后，用无血清培养基将其制成单细胞悬液，计数后，用无血清培养基把细胞以5×10⁵/mL的密度分别与SRC激酶抑制剂PP2（0、1、2、4、8、16 µmol/L）混合，接种到包含8 µm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室内，小室内加入200 µL细胞悬液，下层24孔板的孔内加入含有10%胎牛血清的培养基700 µL，置于5% CO₂、37 ℃及饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，取出小室，用PBS清洗小室，再用棉签拭去小室内的细胞，小室外的细胞使用甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min，倒置显微镜下（200×）随机选择视野拍照，计算细胞数，进行统计学分析，实验重复3次。

采用SPSS软件进行统计学处理，实验数据采取均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。图标绘制采用GraphPad Prism 5。

MTT实验使用不同浓度PP2（0、2、4、8、16、32 µmol/L），分别处理A549细胞24、48、72 h，结果表明，随着PP2浓度的增加，细胞增殖能力明显降低，且在32 µmol/L的PP2处理细胞72 h后，细胞存活率仅为（11.43±0.4）%（图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 PP2对A549细胞的增殖抑制作用 Fig.1 Inhibitory effect of PP2 on proliferation of A549 cells (n=4).

Transwell实验结果显示，使用SRC激酶抑制剂PP2处理细胞24 h，对照组穿膜细胞数为446±23（图 2），且分布密集。给药组（终浓度依次为1、2、4、8、16 µmol/L）细胞穿过微孔滤膜的数量较少且呈零星分散。给药组细胞穿过微孔滤膜的数量随着药物浓度的增大而减少，PP2从低浓度到高浓度，穿膜细胞数依次为361±16、262±20、186±18、102±19、42±10，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P < 0.0001）。

图 2(Fig.2)

图 2 PP2抑制A549细胞的侵袭能力 Fig.2 Inhibitory effect of PP2 on the invasion of A549 cells. A: Changes in invasion capacity of A549 cells after PP2 treatment at different concentrations; B: Number of invading cells after the treatments. ***P < 0.0001 vs control (0 μmol/L) (n=3, original magnification: ×200).

划痕实验结果显示，PP2处理细胞株24 h后，给药组细胞与对照组细胞相比转移能力变弱，不同给药组（终浓度依次为1、2、4、8、16 µmol/L）随着药物浓度的增大细胞转移能力减弱，呈浓度依赖性（图 3）。

图 3(Fig.3)

图 3 PP2抑制A549细胞的转移能力 Fig.3 PP2 inhibits A549 cell metastasis. A: Wound healing assay of A549 cells treated with different concentrations of PP2; B: Normalized total area of wound healing. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001 vs control (n=3, original magnification: ×100).

贴壁细胞使用小分子质粒转染，过表达或者沉默Cx43蛋白后，再进行划痕实验，实验结果显示，过表达质粒处理组比对照组转移能力减弱，过表达质粒处理组中，PP2（浓度4 µmol/L）处理组比只用过表达处理而联合未给药组的转移能力有所减弱；SiRNA沉默蛋白处理组比对照组转移能力增强，SiRNA沉默处理组中，PP2（浓度4 µmol/L）处理组比只用SiRNA沉默处理而未给药组的转移能力有所减弱（图 4）。

图 4(Fig.4)

图 4 过表达质粒或SiRNA处理对A549细胞侵袭能力的作用 Fig.4 Effect of Cx43 overexpression and siRNAmediated Cx43 silencing on PP2-induced inhibition of A549 cell metastasis. A: Wound healing assay of A549 cells after Cx43 overexpression or silencing transfection; B: Normalized total area of wound healing. *P < 0.05, ***P < 0.0001 vs control (n=3, original magnification: ×100).

贴壁细胞使用小分子质粒转染，过表达或者沉默Cx43蛋白后，再进行Transwell实验。实验结果显示，过表达质粒处理组穿膜细胞数比对照组减少（264±14 vs 428±18，图 5），过表达质粒处理组中，加PP2（浓度4 µmol/L）处理组穿膜细胞数比与只用过表达质粒处理而未联合给药组减少（157±10 vs 264±14）。SiRNA沉默蛋白处理组穿膜细胞数比与对照组增多（627±14 vs 428± 18），在SiRNA沉默处理组中，加PP2（浓度4 µmol/L）处理组与只用SiRNA沉默处理而未给药组相比，穿膜细胞数减少（392±13 vs 627±14，P < 0.05）。

图 5(Fig.5)

图 5 过表达质粒或SiRNA处理对A549细胞侵袭能力的作用 Fig.5 Effect of Cx43 overexpression and silencing on PP2-induced inhibition of A549 cell invasion. A: Transwell assay of A549 cells treated with PP2 after Cx43 overexpression and silencing; B: Statistics of the relative cell number; *P < 0.05, ***P < 0.0001 vs control (n=3, original magnification: ×200).

不同浓度PP2（0、1、2、4、8 µmol/L）分别处理细胞24 h后，采用Western blot检测Cx43、MMP-2蛋白表达的影响。结果显示，PP2可以增加细胞内Cx43蛋白的表达，抑制MMP-2的表达。小分子质粒处理后，过表达质粒处理细胞，Cx43蛋白的表达量增加；SiRNA处理，Cx43蛋白的表达量减少，而MMP-2蛋白的表达未受影响（图 6）。

图 6(Fig.6)

图 6 PP2、过表达质粒、SiRNA处理A549细胞株之后细胞中Cx43、MMP-2和GAPDH的表达情况 Fig.6 Western blot for detecting expressions of Cx43, MMP-2 and GAPDH in A549 cells after PP2 treatment, Cx43 overexpression and Cx43 silencing. A: Protein expressions after Cx43 overexpression and silencing; B: Statistical results of the protein expressions after transfection; C: Protein expression after PP2 treatment; D: Statistical results of the protein expressions after PP2 treatment. *P < 0.05, **P < 0.01, #P < 0.05, ###P < 0.0001 vs control group (n=3).

在肿瘤细胞中SRC激酶异常活化，从而促进肿瘤细胞的生长和转移，因此靶向SRC激酶的药物逐渐成为研究热点^[17-18]。当外部信号转导入细胞时，SRC激酶可以迅速被激活并使下游信号转导分子被磷酸化，通过复杂的信号传导过程最终影响细胞的粘附和侵袭能力^[19]。在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤组织中，SRC激酶处于异常活化状态^[20-21]。SRC激酶抑制剂PP2可有效抑制细胞SRC激酶的活性。本研究表明，1、2、4、8、16 µmol/L PP2作用于A549细胞后，显著降低细胞的体外增殖、侵袭和转移能力，且随着浓度的增加而增强。

缝隙连接是细胞间传递物质信号的重要通道，主要由连接蛋白Cx组成，肿瘤的发生发展与Cx的表达异常密切相关，Cx基因的突变及缺失，使缝隙连接通讯异常，因而机体对肿瘤细胞的监视和调控能力减弱，导致肿瘤过度克隆增长；相应Cx基因表达水平增高可以促进肿瘤缝隙连接的形成，增加细胞间信号的交流，阻碍肿瘤细胞的生长与转移^[22-24]。Cx43已成为较公认的抑癌基因^[25]。本研究前期实验证明，在肺癌细胞中主要表达Cx43，且Cx43可以不依赖于缝隙连接的形成而影响细胞的增殖能力^[26-28]。也有研究表明，药物通过抑制SRC激酶的活化，可以增加Cx43的表达和缝隙连接功能，从而进一步说明SRC激酶的活化状态可能导致Cx43发生磷酸化^[29]。本实验调控细胞Cx43的表达，进而观察对A549细胞侵袭转移能力的影响。结果显示，过表达Cx43后，A549细胞的侵袭转移能力明显降低；且进一步增强了PP2降低A549的侵袭转移能力；而沉默Cx43后，A549细胞的侵袭转移能力显著增强，但对PP2的影响不明显。以上实验结果表明，SRC激酶抑制剂PP2可以抑制肺癌A549细胞的侵袭转移能力；调控Cx43蛋白的表达，可以影响PP2对A549细胞侵袭转移能力的作用。也可以初步推断Cx43在A549细胞的侵袭转移过程中起到了非常重要的调控作用。

那么PP2对Cx43蛋白的表达是否有影响呢？实验结果显示，采用4 µmol/L和8 µmol/L的PP2作用于A549细胞后，缝隙连接蛋白Cx43的表达水平增高，基质金属蛋白酶MMP-2表达显著减少。基底膜成分的降解是肺癌细胞侵袭和转移的重要步骤，MMP-2是降解IV型胶原最主要的酶，在肿瘤的血管生成、肿瘤细胞的侵袭和转移灶的形成中起重要作用^[30-32]。而本研究结果进一步表明，PP2可以抑制肺癌A549细胞的侵袭转移能力，该过程伴随Cx43蛋白的表达增多。但是否是通过抑制SRC激酶活性从而增加Cx43蛋白的表达仍需进一步研究。本研究下一步将通过动物实验验证PP2在体内对肺癌细胞A549的转移的抑制。

综上所述，本研究观察了SRC激酶抑制剂PP2对肺癌A549细胞的侵袭转移能力，并探讨了相关机制。初步探索了以Cx43为靶点的肺癌治疗新措施，为临床肺癌治疗提供了新思路。