2019, Vol. 39
2. 华南理工大学医学院，广东 广州 510005
2. School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510005, China
皮肤黑素瘤可源于表皮、真皮、皮下组织甚至皮肤附属器，近年来在我国的发病率成倍增长，占皮肤恶性肿瘤的7%~20%。并且，皮肤黑素瘤恶性程度高、侵袭能力强、易转移、对放化疗极不敏感、预后较差，生存率极低[1-4]。因此，对皮肤黑素瘤的生物学研究显得尤为重要。无胸腺裸鼠制备的皮肤黑素瘤模型易于动态观察肿瘤的生长状态，为科研所常用。
高频超声因其成像视野大、无辐射、价格低廉等特点，被广泛用于皮肤肿瘤边界的评估[5-8]。然而，由于分辨率的限制，高频超声无法对皮肤黑素瘤做出鉴别诊断[9]。光学相干断层成像（OCT）技术作为一种类似于超声检查的光学成像技术[10]，具有高分辨率、高灵敏度的优点，能检测到1~30 μm的早期微小病变[11]，近年来在皮肤科的应用潜力逐渐受到重视[12-15]。基于高频超声和OCT的以上特点，开展了高频超声与OCT技术在皮肤黑素瘤中的相关研究。如利用高频超声（20 MHz）与OCT测量黑色素皮肤损伤患者的浸润深度，发现OCT适用于小于1 mm的肿瘤深度测量，超声适用于大于1 mm的肿瘤深度测量[16]。现有研究表明，高频超声与OCT有可能对皮肤疾病发展过程进行无创监测[17]。上述报道主要针对特定时期的黑素瘤，比较高频超声和OCT的成像结果，但缺少针对黑素瘤动态发展过程的监测研究。
因此，本文应用小动物高频超声和OCT，对皮肤黑素瘤裸鼠模型的肿瘤生长过程进行非侵入性的连续监测，研究其自然发展的影像图特征并对其进行量化分析，比较在此过程中小动物高频超声和OCT的成像结果。高频超声和OCT在肿瘤生长的不同阶段的影像学表现，可在肿瘤生长过程的监测中，对不同影像手段的选择提供参考依据。
1 材料和方法 1.1 材料DMEM培养基（Gibco）、胎牛血清（FBS）（Gibco）、PBS缓冲溶液（Gibco）、0.25%胰蛋白酶和0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）（Gibco）、二氧化碳恒温孵育箱（Thermo）、倒置相差显微镜（Leica M icrosystem s CM S GmbH）、台式离心机（TD5A-WS）、光学相干断层成像系统（欧谱曼迪科技有限责任公司）、超高频小动物超声影像系统（VisualSonics）。人黑素瘤细胞株A375来源于中国科学院细胞库并培养于南方医科大学临床医学实验研究中心。裸鼠（BALB/c）20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性，鼠龄4周，体质量15~ 20 g。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人黑素瘤细胞株A375培养于DMEM培养基（含10%的胎牛血清、100 μ/mL青霉素、100 μ/mL链霉素）中，在5% CO2，37 ℃、饱和湿度条件下培养，细胞消化用0.25%胰蛋白酶，当细胞生长密度达到90%后传代继续培养。
1.2.2 动物分组及模型制备将20只裸鼠随机分为实验组和对照组，其中实验组16只，对照组4只。实验组：收集处于生长对数期的A375细胞，稀释至1×107/mL。取0.2 mL细胞悬液，经皮下注射接种于裸鼠背部，并对注射部位进行标记。对照组：取0.2 mL完全培养液，经皮下注射接种于裸鼠背部。
1.2.3 大体观察自接种后起，每日常规观察接种部位是否有肿瘤形成，若成瘤，观察并记录肿瘤表面皮肤情况（有无溃烂、结节大小、质感等）、实验动物生长状态（体重、精神状态等）有无变化等。
1.2.4 小动物高频超声图像采集本研究采用VisualSonics公司的Vevo2100超高频高分辨率小动物超声影像系统，探头频率34 MHz。经腹腔麻醉后，将实验鼠四肢用医用胶布固定于涂有导电胶的电极上，为俯卧位，成像部位与探头之间放置厚约1.0 cm水囊，进行二维超声检测。
1.2.5 OCT图像采集使用光源中心波长为1310 nm，横向分辨率为12 μm，纵向分辨率为10 μm的频域OCT对裸鼠进行检测。经腹腔麻醉后，将实验鼠四肢用医用胶布固定于检测台。将探头对准成像部位，调整探头与扫描区域的垂直距离，对成像部位进行B型检测。
1.2.6 图像分析及参数测量实验所得高频超声和OCT图像均利用MATLAB软件进行处理分析。感兴趣区（ROI）面积≥0.5 mm2。对于高频超声图像，利用下式计算肿瘤组织与周围组织的对比噪声比（CNR）[18]：
| $ CNR = \frac{{\left| {{E_r} - {E_b}} \right|}}{{\sqrt {{\sigma ^2}_{\left( {{E_r}} \right)} + {\sigma ^2}_{\left( {{E_b}} \right)}} }} $ | (1) |
其中Er为肿瘤组织ROI的信号强度，σ（Er）是其对应的标准差；Eb为周围组织ROI的信号强度，σ（Eb）是其对应的标准差。
对于OCT图像，利用式（2）计算肿瘤组织与周围组织的CNR [19]：
| $ C N R=\frac{\left|M I_{r}-M I_{b}\right|}{S D\left(I_{b}\right)} $ | (2) |
其中MIr和MIb分别为肿瘤组织ROI和周围组织ROI的信号强度，SD（Ib）为背景噪声的标准差。
经OCT、高频超声影像学检查发现肿瘤后，测量并记录肿瘤最大切面的长径（a）、厚径（b），并根据下式计算肿瘤的体积：
| $ V=\frac{1}{2} a \times b^{2} $ | (3) |
BALB/c裸鼠接种肿瘤细胞后24 d，颈椎脱臼处死裸鼠，取肿瘤组织放入10%中性甲醛固定液固定，随后石蜡包埋并切片，切片厚度为3 μm，经HE染色后在显微镜下观察细胞的病理形态学情况。
1.2.8 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件，OCT、超声对肿瘤测量结果以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，当P < 0.05时表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 基本情况实验组16只裸鼠，14只造模成功，造模成功率为87.5%。
2.2 大体观察结果实验结束前，实验组有2只死亡，对照组有1只意外死亡。裸鼠接种后7±2 d，接种部位出现肉眼可见小结节，质硬；接种后第22天，结节处出现暗红色的出血点。整个实验过程中，未见肿瘤局部皮肤出现溃破、流脓等。
2.3 高频超声成像结果成像结果如图 1所示。裸鼠接种后7±2 d，小动物高频超声探测到肿瘤的存在，并能测量肿瘤的大小（图 1G），与大体观察到结节的时间相近。根据图 1发现，与对照组裸鼠的正常皮肤影像相比，实验组裸鼠成瘤后，二维灰阶超声可见肿瘤为椭圆形（类圆形）低回声实质性结节，内部回声尚均匀，边界清晰，周边无暗晕，后方回声未见明显变化（图 1G）。结合裸鼠种瘤后第7、15、20、24天超声图像发现，随着肿瘤体积的增大，肿瘤区域内可见点状或带状强回声信号，后方回声增强（图 1G~J）。CNR计算结果如图 2所示，可以发现，随着种瘤体积的增长，肿瘤组织与周围组织的CNR逐渐增强，其CNR值分别为2.09±0.07、2.23±0.07、3.37±0.09、3.47± 0.12。与第7天CNR计算结果相比，差异具有统计学意义（P < 0.05），第20、24天显著增高（P < 0.001）。
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图 1 皮肤黑素瘤裸鼠模型的高频超声图 Fig.1 High-frequency ultrasonography of cutaneous melanoma in nude mouse. A-E: Ultrasonography of control group on days 5, 7, 15, 20, and 24, respectively; F-J: Ultrasonography of cutaneous melanoma on days 5, 7, 15, 20, and 24, respectively (red dashed box indicates melanoma). |
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图 2 肿瘤种植后四个时间点的CNR图(高频超声) Fig.2 CNR values of HFUS for cutaneous melanoma imaging at 4 time points after cell implantation. *P < 0.05, ***P < 0.001. |
OCT对黑素瘤动态发展过程的监测结果如图 3。裸鼠接种后5±1 d，OCT可探测到肿瘤的存在，并且比小动物高频超声更早发现肿瘤（图 3F）。从图 3A~E中可以看出，健康裸鼠皮肤OCT图像具有层状结构，可清楚分辨表皮、真皮、皮下脂肪及血管。图 3F是OCT在第5天探测到裸鼠皮肤黑素瘤图像，可以看出：黑素瘤在OCT中呈现出颜色较深的小叶状结构，小叶状结构边缘反射增强，图像中颜色较浅，真表皮交界模糊，边缘不清晰，且肿瘤边缘发生凸起，看不出正常组织的分层结构，与对照组裸鼠皮肤图像相比，已完全看不出原来的组织特征。根据种植黑素瘤后第5、7、15、20、24天OCT图像发现，肿瘤逐渐向外围扩展生长，出现真皮上层的扁平化，肿瘤的边界较模糊，呈现中心厚，边缘薄的形状（图 3F~J），其对应的CNR计算结果见图 4。结果表明，自种植后起，肿瘤组织与周围组织的CNR逐渐增强，其CNR值分别为2.44±0.15、2.68±0.12、2.94±0.08、3.38± 0.07、4.04±0.08，第7天与第5天CNR计算结果无明显差异（P>0.05），但是第15、20、24天CNR计算结果高于第5天CNR计算结果（P < 0.001）。
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图 3 皮肤黑素瘤裸鼠模型的OCT图 Fig.3 OCT of cutaneous melanoma in nude mice. A-E: OCT of control group on days 5, 7, 15, 20, and 24, respectively; F-J: OCT of cutaneous melanoma on days 5, 7, 15, 20, and 24, respectively (blue dashed box indicates melanoma). e: Epidermis; jz: Junction zone; d: Dermis; v: Vessel. |
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图 4 肿瘤种植后5个时间点的CNR图(OCT) Fig.4 CNR values of OCT for cutaneous melanoma imaging at 5 time points after cell implantation. ***P < 0.001. |
根据高频超声与OCT的测量结果，绘制皮下肿瘤生长曲线（图 5）。肿瘤长径增长曲线图 5A表明，OCT与高频超声均在种植后第8天起迅速增长，并且在第9~ 10天增长率达到最大，高频超声（99.98±1.13）% vs OCT（102.74±0.80）%，测量结果有显著性差异（P < 0.05）；厚径增长曲线图表明，在种植后第9天起，厚径迅速增长，第16~17天增长率达到最大，高频超声（48.16± 2.05）% vs OCT（50.97±3.03）%，测量结果具有显著性差异（P < 0.05），OCT由于穿透深度的限制，在种植后24 d无法准确测量肿瘤厚径（图 5B）；另外，根据图 5A和图 5B发现，与高频超声相比，OCT的测量结果更灵敏，特别是对于厚径的测量。
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图 5 肿瘤生长曲线 Fig.5 Tumor growth curve. A: Tumor length curve; B: Tumor depth curve; C: Tumor volume curve. *P < 0.05. |
肿瘤体积趋势图表明，肿瘤在种植后第14天前发展速度缓慢，之后快速增长（图 5C）。高频超声和OCT监测过程中发展速度较快时间段均在种植后第14~17天，其中第16~17天增长速度最快，增长率分别为（143.10±2.28）%和（145.97±2.08）%，测量结果差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.6 病理结果肿瘤大体呈类圆形或结节状，包膜基本完整，质地较硬，易剥离。将瘤体制作病理切片后，行HE染色法观察。结果显示，瘤组织排列结构复杂，肿瘤细胞大小、形态不一，细胞核大小、形态、染色不一，染色质分布不均匀，核浆比例失调，细胞异型性明显，可见较多病理性核分裂象（图 6D~F）。
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图 6 对照组与实验组皮肤HE染色 Fig.6 HE staining of skin tissues in control group (A-C) and experimental group (D-F) (Original magnification: ×200). |
随着皮肤影像技术的不断发展，多种新技术手段逐渐应用于皮肤黑素瘤的诊断并发挥重要作用[20-22]。超声技术的发展使得高频超声逐步应用于黑素瘤诊断、深度测量、边界判定[8, 23]。本研究发现，高频超声在种植后7± 2 d发现肿瘤，与大体观察发现时间相近。由于黑素瘤在高频超声下呈现的低回声为非特异性，故高频超声很难为皮肤黑素瘤做定性诊断[24]。随着肿瘤体积的增长，低回声肿瘤区域内出现的点状或带状强回声信号，可能是肿瘤内出现某些微钙化物质所致[25]。这与Botar等报道的研究结果相同[26-27]。
鉴于皮肤光学穿透的易实现性，OCT技术在皮肤肿瘤的应用潜力逐渐得到了重视。Gambichler等[28]利用OCT对良、恶性黑色素皮肤损伤进行形态学检测，并行病理切片进行一致性检验，初步实现OCT对良恶性黑色素皮肤损伤的在体非侵入性的检测。Moraes等[29]利用OCT对39例黑色素皮肤损伤患者检测，总结出黑色素皮肤损伤特有的影像学特征。因此，OCT可特异性区分黑素瘤与正常组织。本研究显示，OCT在肿瘤种植后5±1 d发现肿瘤，比高频超声更早发现肿瘤，这得益于OCT的高分辨率。黑素瘤在OCT图像中表现为黑色或灰色的小叶状结构，这是黑色素高散射的结果。本实验所使用的OCT系统，其中心波长为1310 nm，黑色素对该波长的光散射较大，使肿瘤处信号降低[30]。在肿瘤发生发展后期，OCT不足以明确肿瘤的大小，对厚径、体积的测量没有高频超声准确，主要来自皮肤组织本身所具有的散射特性的影响[31]。
以往研究发现高频超声在检测黑素瘤深度方面效果不如OCT，因其分辨率低导致厚度小于1mm的黑素瘤边界被过度评估。此外，由于样本的限制，无法对黑素瘤动态发展过程中不同时期下高频超声与OCT的成像结果进行比较分析[32]。本实验在建立裸鼠黑素瘤模型后，每天对肿瘤模型进行高频超声与OCT成像并对其进行量化分析。超声与OCT的图像量化分析结果显示，肿瘤组织与周围组织的CNR逐步增加，这可能与肿瘤的尺寸有关[33]。成像结果比较显示，OCT在肿瘤发展前期，对黑素瘤厚径的检测灵敏度高；而高频超声因为其分辨率不如OCT，导致在肿瘤前期对黑素瘤厚径检测差异较大。但在种瘤后12 d起，高频超声比OCT能更准确地确定肿瘤边界，这与以往文献报道结果具有一致性[34]。对于不同时期的皮肤黑素瘤，正确地选择成像设备是至关重要的。与高频超声相比，OCT的分辨率更高但渗透深度有限，可对肿瘤潜伏期进行动态监测；高频超声在肿瘤组织与周围组织的对比度优于OCT，可精确测量肿瘤中后期体积的发展及边界划分，提示在后续的相关研究中，不同阶段应根据需要选择合适的影像学手段进行监测。
综上所述，利用高频超声和OCT，可以在活体研究黑素瘤生长过程中形态学的变化情况，进行定性和定量的分析，为以后在肿瘤模型研究中实验动物的活体影像学监测手段的选择累积经验。
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