子痫前期（PE）是妊娠期特有疾病，约影响全球5~ 8%的妊娠妇女，是引起孕妇和围产儿死亡的主要原因之一，除了娩出胎盘，目前尚无有效治疗手段^[1]。PE发病机制未完全明确，普遍考虑为多因素共同作用的结果，如子宫螺旋动脉重铸障碍，胎盘源性生理物质分泌异常，母体全身炎症反应等^[2-4]。

维生素D是人体内不可或缺的类固醇激素，它非经典作用方面的功能越来越受重视，对其抗癌作用以及免疫功能调节分子机制的研究已成为热点^[5-6]。越来越多的证据表明维生素D缺乏可能与PE的发病有关^[7-8]。MircoRNA-21（miR-21）是目前发现的在恶性肿瘤、心血管疾病、免疫性疾病等多种疾病中均高表达的microRNA（miRNA），被视作一种原癌基因^[9-14]。许多报道表明PE患者存在miR-21表达的失调，不过，miR-21在PE患者体内是高表达还是低表达始终未能得到一致的结论^[15-19]。研究表明维生素D可通过直接机制（维生素D反应元件VDRE）和间接机制（影响成熟miRNA发生）调节miRNA的表达^[20]，通过调节miRNA表达，维生素D参与了多种疾病的发生发展过程^[21-24]。已有研究报道指出维生素D可促进绒毛外滋养细胞侵袭^[25]，但是，维生素D是否通过靶向miRNA影响PE细胞运动性及其具体机制尚未明确。本研究主要检测了胎盘滋养细胞系中，维生素D水平对miR-21表达情况的影响以及维生素D协同miR-21对滋养细胞迁移侵袭能力的影响，以期进一步探讨二者在PE发病机制中的作用并为PE治疗提供新思路。

人胎盘滋养细胞株HTR-8/SVneo（HTR）购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，RPMI 1640培养基、Opti-MEM培养液（Gibco），胎牛血清（BD）。1, 25二羟维生素D3[1, 25(OH)₂D₃]（Sigma），miR-21 mimic、miR-21 inhibitor及其对应的miRNA阴性对照均由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染试剂Lipofectamine2000（Invitrogen），RNA提取逆转录和实时荧光定量所用试剂（QIAGEN），miR-21引物和内参U6引物（吉码）。Transwell小室和BD基质胶（Corning），小鼠抗人GAPDH抗体、兔抗人MMP9抗体（Santa Cruz），兔抗人E-cadherin、Fibronectin抗体（Abcam）。

HTR细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO₂无菌培养箱中培养，每2~3 d传代1次，取对数期生长细胞进行实验。细胞融合度达80%左右后按转染试剂说明书进行转染；若需联合1, 25(OH)₂D₃刺激细胞，则在转染6h换培养基时加1, 25(OH)₂D₃。

1, 25(OH)₂D₃以无水乙醇配制成100 µmol/L的贮存液，-20 ℃避光保存。取对数期生长细胞，胰酶消化后制备成单细胞悬液，接种到6孔板，密度为2×10⁵/孔。待细胞贴壁后，实验组加1, 25(OH)₂D₃, 工作浓度分别为0.1、1、10 nmol/L，并设空白对照组，培养箱中分别培养24、48、72 h，按试剂盒说明书提RNA，RT-qPCR实验检测miR-21表达情况。以U6作为参考，所用引物序列如下：

miR-21：F primer：ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG

R primer：AATGGTTGTTCTCCACACTCTC

U6：F primer：CAGCACATATACTAAAATTGGAACG

R primer：ACGAATTTGCGTGTCATCC

取24孔板Transwell小室，上室中加入单独转染miR-21 mimic/ inhibitor或联合10 nmol的1, 25(OH)₂D₃处理的HTR细胞悬液（浓度为2.5×10⁵/mL）200 μL，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基600 μL，37 ℃培养箱继续培养24 h后，用棉签擦拭掉上室中未穿过膜的细胞，PBS冲洗小室3次，甲醇固定约20 min，0.1%结晶紫溶液中染色10 min后，倒置显微镜下随机选取5个视野，200倍光学显微镜下拍照计数每个视野内穿透小室微孔膜的细胞数，计算平均数，随后做统计学分析。细胞侵袭实验的Transwell小室上室提前加入100 μL按说明书稀释后的Matrigel胶，细胞接种数目为1×10⁵/孔，培养时间为36~48 h，其余操作同迁移实验。

取对数生长期细胞，经相应处理后，提取蛋白质，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，将蛋白转移到硝酸纤维膜上，4 ℃封闭过夜后加入一抗，4 ℃过夜后加入二抗，室温下孵育3 h。用化学发光试剂增强反应，以凝胶成像系统分析结果。

采用GraphPad Prism7软件进行统计学分析，对两组数据比较采用t检验，实验数据以均数±标准差表示；对多组数据比较采用单因素方差分析，实验数据以95% CI表示。P < 0.05为差异具有统计学意义。

不同浓度1, 25(OH)₂D₃作用细胞株后抑制了miR-21的表达，抑制作用呈浓度-时间依赖性增强（图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 不同浓度1, 25(OH)2D3刺激HTR细胞24、48、72 h后miR-21的表达水平 Fig.1 Expression levels of miR-21 in HTR cells after stimulation by 0, 0.1, 1 and 10 nmol/L 1, 25(OH)2D3 for 24, 48 and 72 h (*P < 0.05; **P < 0.01 vs control).

与阴性对照相比，转染miR-21 mimic后HTR细胞的迁移和侵袭能力受到抑制（P < 0.05）。与阴性对照组相比，转染miR-21 inhibitor后促进了HTR细胞的迁移和侵袭能力（P < 0.05，图 2）。

图 2(Fig.2)

图 2 Transwell实验检测miR-21 mimic /inhibitor刺激HTR细胞后对HTR的迁移、侵袭能力的影响及统计分析 Fig.2 Transwell assayfor assessing the migration and invasion of HTR cells after transefection with the miR-21 mimic and inhibitor (A, C) and quantitative analysis of the results (B, D). *P < 0.05.

与单独转染miR-21mimic组相比，miR-21mimic联合1, 25(OH)₂D₃刺激细胞减弱了miR-21过表达对HTR细胞迁移和侵袭的抑制作用（P < 0.05）。与inhibitor组相比，miR-21 inhibitor联合1, 25(OH)₂D₃刺激则与单独转染miR-21 inhibitor对HTR细胞的迁移、侵袭能力无明显改变（P>0.05）。

图 3(Fig.3)

图 3 Transwell实验检测miR-21 mimic/inhibitor联合1, 25(OH)2D3刺激HTR细胞后对HTR的迁移、侵袭能力的影响及统计分析 Fig.3 Transwell assayfor assessing the migration and invasion of HTR cells after transefection with the miR-21 mimic and inhibitor in the presence or absence of 1, 25(OH)2D3 (A, C) and quantitative analysis of the results (B, D) (*P < 0.05, **P < 0.01). Transwell assayfor assessing the migration and invasion of HTR cells after transefection with the miR-21 mimic and inhibitor (A, C) and quantitative analysis of the results (B, D). *P < 0.05.

WB结果显示，HTR细胞转染miR-21mimic后，上皮标记物E-cadherin蛋白表达水平增加，间充质标记物fibronectin蛋白表达水平降低，MMP9表达水平降低。瞬时转染miR-21 inhibitor则结果相反（图 4）。

图 4(Fig.4)

图 4 Western blot检测miR-21mimic/inhibitor刺激HTR后EMT相关蛋白的表达情况 Fig.4 Western blot analysis of expressions of EMT-related proteins in HTR cell after transfection with the miR-21 mimic or inhibitor (*P < 0.05, **P < 0.01).

按要求对细胞经相应处理后，WB结果显示，联合1, 25(OH)₂D₃后，与单独转染miR-21mimic相比，Ecadherin蛋白表达降低，Fibronectin、MMP9蛋白表达增加；与单独转染miR-21inhibitor相比，蛋白表达水平无明显变化（图 5）。

图 5(Fig.5)

图 5 Western blot检测miR-21mimic/inhibitor联合维生素D刺激HTR后EMT相关蛋白的表达情况 Fig.5 Western blot analysis of the expressions of EMT-related proteins in HTR cells after transfection with the miR-21 mimic/inhibitor in the presnce or absence of vitamin D (*P < 0.05).

近年来关于维生素D对人类机体健康影响的研究有了明显的进步。除了经典的调节钙磷代谢、影响骨骼发育外，它的抗炎症和抗癌特性越发引起人们的关注。目前许多miRNA被鉴定为维生素D靶标，如miR-17/ 22/100/146/155/21等^{[21, 24-25]}。虽然，关于维生素D调控miRNA表达的研究较多，但有关维生素D在PE疾病中对miR-21表达的调控以及二者在PE发病机制中起何种作用的研究还不得而知。

在前期研究中，我们发现与健康妊娠妇女相比，PE患者存在维生素D水平降低和胎盘miR-21表达水平升高的现象。本次实验中，我们使用最常见的维生素D活化型产物—1, 25(OH)₂D₃刺激HTR细胞，发现1, 25(OH)₂D₃可抑制HTR细胞miR-21的表达，且抑制效果呈一定的浓度-时间依赖性增强。这表明1, 25(OH)₂D₃可能通过减弱PE患者高表达的miR-21从而影响PE的病理过程。

大量研究表明miR-21可通过不同机制调节多种癌细胞的侵袭性^{[10-12, 26-27]}，考虑到胎盘滋养细胞侵袭能力不足是PE发病的重要原因之一，我们推测胎盘中异常表达的miR-21也可能参与到滋养细胞的运动过程。于是，我们进行transwell实验研究了miR-21单独或联合1, 25(OH)₂D₃共同刺激细胞时对细胞迁移和侵袭的影响。结果显示，与NC组相比，转染miR-21mimic后抑制了HTR细胞的迁移和侵袭能力，当联合1, 25(OH)_2D3后减弱了该抑制作用。转染miR-21 inhibitor后可促进HTR细胞的迁移与侵袭能力，然而，用1, 25(OH)₂D₃联合miR-21 inhibitor共同刺激细胞时，与单独miR-21 inhibitor刺激相比，细胞迁移和侵袭能力无明显变化。不同的刺激因素可能造成相似的细胞功能表现，但它们作用于细胞时具体激活了细胞的哪条通路以及miR-21抑制HTR细胞运动能力的具体机制，我们还不得而知。此外，1, 25(OH)₂D₃与miR-21 inhibitor两种处理方式均可抑制miR-21水平，细胞受外界刺激引起相应改变是要在一定的阈值以内的，当miRNA水平被一种刺激因素抑制到一个临界值时，继续增加刺激或许并不会有太明显的变化。这也许是此次研究中未能出现预期的1, 25(OH)₂D₃联合miR-21 inhibitor可协同促进HTR细胞迁移和侵袭的原因。

E-cadherin在母-胎界面的蜕膜上皮细胞及滋养细胞广泛表达，赵洪波等人研究表明高表达的E-cadherin可抑制滋养细胞的侵袭性^[28]。Fibronectin在细胞粘附、生长和迁移中发挥重要作用，其表达水平与PE的严重程度具有一定的正相关性^[29-30]。MMP9主要由滋养细胞分泌，它的表达有助于滋养细胞的侵袭和细胞外基质的溶解，MMP9异常可影响滋养细胞的侵袭能力，导致血管重铸不全^{[4, 31]}。因此我们WB验证了细胞经相应处理后这些蛋白的表达情况。实验结果显示，miR-21过表达能上调E-cadherin，下调Fibronectin、MMP9蛋白的表达，而1, 25(OH)₂D₃能减弱该调控作用，转染miR-21 inhibitor则出现相反的结果，这与transwell实验结果相对应。进一步阐明了1, 25(OH)₂D₃可能通过抑制miR-21表达，引起EMT相关蛋白和MMP9蛋白表达的改变，进而影响滋养细胞的运动能力。

本次研究也存在一些不足之处。滋养细胞有JEG、HTR、BeWo、人绒毛膜滋养细胞4种细胞系，此次实验目前只选择了HTR这一种细胞株，尚需同步其他几种滋养细胞株实验进行验证。此外，我们仅在细胞水平进行了验证，补充维生素D是否能通过降低miR-21来缓解PE的临床症状或疾病进展，以到达治疗PE的目的，这还需要进一步的动物实验加以验证。

综上所述，维生素D和miR-21与PE的发生、发展关系密切。维生素D可能通过抑制miR-21的表达促进滋养细胞的迁移与侵袭，从而影响PE的病理过程。本实验为维生素D对PE作用的进一步研究及应用于临床提供实验依据。随着研究的深入，维生素D在PE的临床防治上将会有更广泛的作用。