2019, Vol. 39
2. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405
2. First Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
慢性肾脏病（CKD）是导致终末期肾衰竭的主要原因之一[1-2]，蛋白尿与肾小球损伤和肾小管间质纤维化的发生发展密切相关，是CKD的主要临床表现[3]。西医对CKD尚缺乏有特异性的治疗，而祖国医学在治疗CKD蛋白尿方面疗效较好并显示出了优势。肾病Ⅲ号方是广东省名中医、南方医科大学罗仁教授基于中医辨证论治理论总结出的经验方，经过多年临床实践，疗效确切且已获得专利授权（专利号：ZL201310015461.1）。全方由《伤寒论》牡蛎泽泻汤化裁而来，由海藻、黄芪、丹参、熟地黄、牡蛎、鱼腥草、荆芥穗7味中药组成，长期的临床观察证实其治疗CKD蛋白尿疗效好，但其作用机制至今尚不明确[4]。
目前针对中药复方有效成分及其治疗作用机制的研究主要是通过动物实验、细胞实验等方法进行，对于获得其作用机制网络的整体面貌、解决成分复杂中药复方的作用机制存在一定困难。近年来，随着科学技术的不断发展，网络药理学的兴起为庞大、复杂的中药系统的深入研究提供了新的思路和视角[5]。本研究运用网络药理学的方法对肾病Ⅲ号方的活性成分及作用靶点进行预测分析，探讨其组方的合理性和治疗CKD蛋白尿的科学性，并将进一步研究其治疗CKD蛋白尿的作用机制，为肾病Ⅲ号方临床应用提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）UniProt数据库（https://www.uniprot.or-g/）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；Cytoscape 3.6.1软件；SPSS 21.0统计软件。
1.2 药物分子信息的收集和活性成分的筛选在TCMSP中选择“Herb name”检索得到海藻、黄芪、丹参、熟地黄、鱼腥草、荆芥穗的分子ADME参数信息，由于该数据库尚未收录牡蛎相关的分子信息，故通过查阅文献得到牡蛎相关的成分，并在TCMSP中选择“Chemical name”得到这些成分的ADME参数信息。然后根据每个分子的口服生物利用度（OB）和类药性(DL)筛选出肾病Ⅲ号方中各中药可能的活性成分。
1.3 网络的构建与分析通过TCMSP数据库搜索与“1.2”中筛选出的活性成分相关的潜在靶点。在GeneCards数据库的搜索框内输入“proteinuria”，在结果显示的全部蛋白尿相关靶点中寻找与上述筛选出的靶点相同的靶点。然后在Cytoscape 3.6.1软件中生成一个体现药物活性成分-靶点相互作用的网络图。
1.4 基因通路的富集分析利用Uniprot数据库将“1.3”中筛选出的在TCMSP中命名不规范的靶点名称校准为官方名称。并利用Cytoscape 3.6.1软件APP中的ClueGO 2.5.2进行基因通路的富集分析。ClueGO参数设置如下：在Control Panel中选择“Homo Sapiens[9606]”，在ClueGO Settings中的“Ontologies/Pathways”中选择KEGG，并设置只显示pV≤0.05的通路以及设置富集结果至少包含3个基因。
2 结果 2.1 药物活性成分的筛选及分析在TCMSP中检索出与肾病Ⅲ号方7味中药有关的全部化合物，根据OB≥30%和DL≥0.18[6-7]的筛选条件得到海藻有4个、黄芪20个、丹参65个、熟地黄2个、牡蛎2个、鱼腥草7个、荆芥穗8个活性成分，其中海藻、黄芪、鱼腥草含有相同活性成分1个，丹参与荆芥穗、荆芥穗与熟地黄、黄芪与鱼腥草、荆芥穗与熟地黄各含有相同活性成分1个，共得到102个活性成分（表 1）。
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表 1 肾病Ⅲ号方7味中药中通过OB和DL预测的102个活性成分 Tab.1 The 102 active ingredients predicted by OB and DL in Shenbing decoction Ⅲ |
对这些活性成分进行分析，发现丹参中的紫丹参萜醚b（M07064）在102个活性成分中具有最高的OB值，为110.32%；黄芪中的9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(M00379)在102个活性成分中具有最高的DL值，为0.92。另外，102个活性成分中有92个(90.2%)活性成分的Caco-2≥-0.4，表明肾病Ⅲ号方是极易穿透小肠上皮细胞而被小肠吸收的。利用SPSS 21.0软件对102个活性成分的ADME参数MW、ALogP、Hdon、Hacc、RBN的极小值、极大值、均值和标准差进行统计，发现全部活性成分的5个参数均值均满足五倍率法则[8]（Lipinski's rule of five），即MW≤500 g/mol，ALogP≤5，Hdon≤5个，Hacc≤10个，RBN≤10个，说明这些活性成分具有更好的药代动力学性质，肾病Ⅲ号方更适合作为口服药物被人们使用（表 2）。
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表 2 肾病Ⅲ号方102个活性成分的部分分子信息统计结果 Tab.2 Statistical results of the molecular information of the 102 active components of Shenbing decoction Ⅲ |
在TCMSP上查找筛选出的102个活性成分作用的潜在靶点，其中M00374、M00398、M00438、M02372、M04345、M07051、M07118、M07140、M07149、M10861这10个活性成分在数据库中还未有相关的靶点，故共找出潜在靶点126个，具体靶点结果见图 1。在GeneCards数据库中检索蛋白尿的全部相关靶点，结果显示，图 1中的126个靶点有69个靶点与蛋白尿相关，通过Cytoscape 3.6.1软件将90个活性成分（M00439与M07142无对应蛋白尿相关靶点）与69个蛋白尿相关靶点相连，绘制出肾病Ⅲ号方的“活性成分-靶点”相互作用的网络图（图 2）。网络图能更直观地反映这些活性成分与靶点间的相互作用。分析此网络拓扑结构，发现此网络包含了159个节点（90个活性成分和69个靶点）和983条边。在网络中，红色节点代表活性成分，黄色节点代表靶点，一个节点的度值（Degree）表示网络中与该节点相连的全部路线条数，如每一个红色节点的度值代表活性成分所拥有的的靶点数；而每一个黄色节点的度值则代表与靶点相关的所有活性成分数。
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图 1 102个活性成分作用的126个潜在靶点图 Fig.1 The 126 potential targets of the 102 active ingredients. |
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图 2 肾病Ⅲ号方的“活性成分-靶点”相互作用的网络图 Fig.2 Network diagram of the active ingredient-target interaction of Shenbing decoction Ⅲ. |
从图 2可以看出，槲皮素（M00098）具有最多的潜在靶点51个，其次是山奈酚（M00422）有30个。从靶点的角度研究发现，雌激素受体（ESR1）有着最多的相互作用配体，为82个，其次是雄激素受体（AR）和前列腺素G/H合酶2（PTGS2），分别有79、69个相互作用配体。此外，该网络的90个活性成分均至少与2个靶点相连，而在69个靶点中，约68.1%的靶点能同时接受肾病Ⅲ号方中2个或2个以上活性成分的调控，说明肾病Ⅲ号方中含有的活性成分可能作用于整个生物网络系统，且不同活性成分可以作用在相同的靶点上，反映出中药作用的整体性与复杂性，也体现了中药“多成分-多途径-多靶点”的综合调节作用特点。
2.3 基因通路的富集分析利用ClueGO对图 2中的69个靶点进行KEGG通路富集分析，结果显示流体剪切应力和动脉粥样硬化（主要包含Toll样受体、NF-κB、MAPK信号通路等）为显著性最高的通路；另外还得到前列腺癌、膀胱癌、百日咳、人巨细胞病毒感染、IL-17信号通路、南美锥虫病（美洲锥虫病）、弓形虫病、乳腺癌、非小细胞肺癌、HIF-1信号通路、卵巢类固醇生成、胰岛素抵抗、松弛素信号通路、补体和凝血级联、癌症途径、间隙连接共17条显著性较高的通路（图 3）。
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图 3 基于ClueGO的KEGG通路富集分析 Fig.3 ClueGO-based KEGG pathway enrichment analysis. A: Enrichment analysis network diagram; B: Enrichment analysis pie chart. |
网络药理学是基于“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络的基础上，系统综合地观察药物与疾病间的关联性，同时揭示多分子药物协同作用的特点[5]。这与中药防治疾病具有“多成分-多途径-多靶点”的综合调节作用特点不谋而合。因此，网络药理学可以为中药复方作用机制的研究提供更全面的认识。
慢性肾脏病属于中医学“水肿”、“腰痛”、“虚劳”等范畴，以蛋白尿为主要临床表现，蛋白质作为构成人体和维持生命活动的基本物质，与中医中的“精气”、“精微”等相似，中医强调这些物质在人体内宜藏不宜泄[3]，治宜补肾益气，降浊排毒。罗仁教授为此研制出可治疗CKD蛋白尿的肾病Ⅲ号方。方中海藻清热祛痰，利水消肿，重用为君。黄芪补中健脾，益卫固表；熟地黄补血滋阴，一则肾强脾健则水湿得化，二则气行则水行，水肿得治，二者共用为臣。牡蛎敛阴固涩，以固蛋白等精微物质不致流失；丹参活血凉血祛瘀，鱼腥草清热解毒，利尿通淋，二药合用以去体内湿热瘀毒；荆芥穗祛风解表，与黄芪共同加强益卫固表之效，合鱼腥草以增加解毒去浊之力。四者均为佐药。全方组方严谨，用药精良，共奏补肾益气，降浊排毒之功[9]。通过运用网络药理学的相关理念和技术，从肾病Ⅲ号方中筛选得到了102个活性成分，且方中中药之间含有共同的活性成分，这为该方联合用药的科学性提供了一定的药效物质基础；90.2%的活性成分容易被小肠吸收，且全部活性成分满足五倍率法则，说明肾病Ⅲ号方组方合理，适合作为口服药物被人们使用。
本次研究分析预测获得肾病Ⅲ号方活性成分的靶点有126个；使用GeneCards数据库查找蛋白尿的相关靶点，发现126个靶点中有54.8%的靶点是与蛋白尿有关的，可表明肾病Ⅲ号方治疗CKD蛋白尿的合理性。通过肾病Ⅲ号方的“活性成分-靶点”网络可见，度值最高的活性成分为槲皮素和山奈酚，二者均是天然黄酮类化合物，广泛存在于自然界。现代药理学研究表明，槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用，在肝、心、肺、肾、骨、神经、眼等疾病中发挥一定的治疗作用[10]。与槲皮素化学结构类似的山奈酚在抗肿瘤、抗氧化、抗生育、抗骨质疏松及降血糖等方面具有较高的药用价值，已在临床上用于治疗胃癌及心脑血管疾病[11]。目前已有许多研究表明槲皮素可通过抑制TGF-β1诱导的肾小球足细胞转分化、减轻TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化等对以蛋白尿为主的肾病有一定的治疗作用[12-15]。山奈酚主要被证实可能通过调控p38 MAPK信号通路、抑制NF-κB介导的炎症反应、增加Sirt3的表达及调控ROS敏感的Akt/Fox O3a信号通路发挥其抗氧化及抗凋亡作用，对糖尿病引起的蛋白尿等肾脏损害起到一定的保护作用[16-18]。度值最高的靶点为雌激素受体（ESR1）、雄激素受体（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2），其中PTGS2也称COX-2，被报道参与足细胞损伤、肾间质纤维化等多种肾脏病理过程[19-20]；ESR1、AR在促进肾癌细胞侵袭和增殖的过程中起到重要作用[21-22]。故而推测：槲皮素和山奈酚可能通过作用于关键靶点ESR1、AR、PTGS2在肾病Ⅲ号方的药理功能中发挥着相对重要的作用。这可能为深入研究肾病Ⅲ号方治疗CKD蛋白尿提供新的思路。
ClueGO结果表明，流体剪切应力和动脉粥样硬化通路为显著性最高的通路，已有研究证实该通路包含的Toll样受体、NF-κB、MAPK信号通路等主要通路与CKD蛋白尿密切相关。其中Toll样受体信号通路被认为参与了肾纤维化过程中成纤维细胞、巨噬细胞和单核细胞等细胞的活化，且可通过TLR2-MyD88-NF-κB途径参与蛋白尿引起肾小管间质炎症的过程[23-24]。NF-κB信号通路是炎症相关的经典通路，尿蛋白可激活肾小管上皮细胞中NF-κB信号通路，合成炎症趋化因子，引起炎症反应，加速肾小管损伤，抑制TLR4/NF-κB途径可有效缓解慢性肾炎蛋白尿的症状[25-26]。MAPK信号通路可直接影响细胞外基质生成，进而影响肾脏纤维化及蛋白尿的产生；抑制PKC/MAPK通路的活性可上调人足细胞裂孔膜上的特异性蛋白nephrin和podocin，从而保护足细胞，延缓CKD进展[27-28]。另外，VEGF的上调可导致肾小球系膜细胞的增殖，并加速其凋亡；HIF-1α在肾小管上皮细胞的高表达，可加重肾小球肥大、细胞外基质积聚和尿蛋白的排泄等[29]。表明VEGF、HIF-1信号通路等中的部分关键因子也与CKD蛋白尿关系密切。加之近年来研究结果还表明晚期糖基化终产物（AGEs）与其细胞结合受体（RAGE）成为终末期肾病发病机制中的新风险因素[30]。因此，ClueGO结果不但表明了使用肾病Ⅲ号方治疗CKD蛋白尿是具有科学性的，并且为后续探讨肾病Ⅲ号方治疗CKD蛋白尿机制提供了思路。
综上所述，本研究初步阐明肾病Ⅲ号方作为经验方的组方合理性及其治疗CKD蛋白尿的科学性，后期仍需通过进一步的体内外实验加以证明，以期为肾病Ⅲ号方治疗CKD蛋白尿临床应用提供可靠的理论依据。
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