手术刺激能引起一系列显著的免疫功能改变，包括淋巴细胞数量和增殖及细胞因子的改变。蔡诚毅等^[1]研究发现手术相关的炎性反应，可抑制细胞因子水平，抑制免疫细胞的表达，对细胞免疫平衡产生一定的负性影响。疼痛是引起术中和术后恢复期免疫抑制的重要因素，疼痛作为一种应激刺激将导致不良的应激反应，对免疫功能产生影响^[2]。术后疼痛可引起NK细胞活性降低，脾脏T淋巴细胞增殖反应也受到抑制^[3-4]。可见，机体术后免疫功能均有不同程度的抑制。针灸疗法具有调和气血、平衡阴阳，疏通经络的作用，能调节机体的特异和非特性免疫功能^[5-8]。理论上讲，电针治疗能调节机体的免疫功能，可以用于围术期以促进机体术后的免疫恢复。但其临床效果如何？其作用机制如何？目前研究不多，尚未能将此技术推广应用于临床。本研究拟采用手术麻醉的应激大鼠为模型，通过测定围术期T淋巴细胞及细胞因子水平，探讨电针足三里穴对围术期大鼠机体细胞免疫功能的调节作用。关于电针穴位可否调节手术麻醉后大鼠细胞免疫功能的实验研究，国内外尚未见类似文献的报道。因此，我们创新性的提出研究假设，把电针技术作用于手术麻醉后的大鼠，探究其免疫状态的改变，从而明确电针的免疫调节作用。如果本研究成功，首先明确电针的免疫调节作用及其机制，将有利于把这一医疗技术创新性的推广应用于临床围术期，从而有效保护和调节机体术后免疫功能，加快术后的临床恢复，提高医疗质量。

选取42只SD大鼠（由中山大学实验动物中心提供），分为3组，空白组（6只）、模型组（18只）、电针组（18只），模型组及电针组经3%戊巴比妥（0.1 mL/kg）腹腔麻醉后行大腿切开并股骨离断术，电针组于麻醉前及手术后1 h，在双侧足三里穴（膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处），取针灸针垂直进针5 mm左右，稍作捻转，随即以电针仪施以密波、频率为50 Hz电刺激15 min，刺激强度以穴位局部肌肉轻微抽搐，大鼠安静为宜，空白组不予任何处理。3组分别于观测时间点称重处死，取SD大鼠心室血，流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8的含量并计算CD4/CD8，ELISA检测IL-1、IL-6。

模型组及电针组SD大鼠分别于术后6 h（T1）、24 h（T2）、72 h（T3）称重处死，取心室血，流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8）的水平，并计算CD4/ CD8；同时取血清ELISA法测定细胞因子IL-1、IL-6水平，所得数据分别与空白组（T0）对照。

SD大鼠处死后迅速取心室血，EDTA抗凝，取抗凝血50 μL分别加入10 μL CD3、CD4、CD8单克隆抗大鼠抗体，避光孵育20 min，加入2 mL溶血素，作用10 min后，用PBS洗细胞1次，PBS重悬细胞后用流式细胞仪检测。

（1）从冰箱中取出标本，20 min，平衡至室温；（2）标准品配制，标准曲线使用以下浓度：2000、1000、500、250、125、62.5、32.25、15.625 pg/mL；（3）取出孔板，除2个空白孔外，分别将标本和不同浓度的标准品（100 μL/孔）加入相应孔中，用封板胶封闭反应孔，37 ℃孵箱中孵育90 min；（4）各孔中加入350 μL洗涤液，静置30 s后，甩尽吸干液体，重复4次；（5）除空白孔外，加入生物化抗体（一抗）工作液100 μL/孔，用封板胶封闭反应孔，37 ℃孵箱中孵育60 min；（6）洗板4次，除空白孔外，加入酶结合物抗体（二抗）工作液100 μL/孔，用封板胶封闭反应孔，37 ℃孵箱中孵育30 min；（7）洗板4次，加入显色剂100 μL/孔，避光37 ℃孵箱中孵育15 min；（8）加入终止液100 μL/孔，混匀后立刻测量吸光度A₄₅₀。通过所得出的A₄₅₀与标准曲线进行对比，可分别得出IL-1、IL-6的水平。

所得数据均以均数±标准差表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。组内不同时间点比较采用配对样本t检验，组间相应时间点比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

3组SD大鼠的性别、体质量、手术时间差异均无统计学意义（P > 0.05）。

SD大鼠围术期T淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8）水平在各相应时间点，模型组CD3水平均明显低于电针组，其下降幅度明显大于电针组；术后24、72 h，模型组CD4水平均低于电针组，下降幅度也大于电针组；模型组CD4/CD8术后24、72 h较空白组明显下降，电针组则无明显变化，术后24、72 h，模型组及电针组CD4/ CD8有明显差异，模型组低于电针组（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 两组不同时间血清T淋巴细胞亚群的比较 Table 1 Comparison of serum T cell subpopulations at different time points between the two groups (Mean±SD, n=6) Indicators Group T0 T1 T2 T3 CD3 (%) M 67.3±8 49.8±18** 48.5±13** 58.4±16* E 67.3±8 59.2±9**Δ 60.1±9*ΔΔ 68.2±9Δ CD4 (%) M 35.2±5 23.3±8** 22.2±5** 31.7±7* E 35.2±5 29.1±8**Δ 31.3±8ΔΔ 34.1±7 CD8 (%) M 25.1±4 23.5±10 23.9±6 25.8±3 E 25.1±4 25.2±8 23.6±6 24.4±5 CD4/CD8 M 1.45±0.3 1.21±0.8 1.12±0.6* 1.22±0.4* E 1.45±0.3 1.31±0.6 1.51±0.6 1.62±0.5Δ Comparing in same group, T1, T2, T3 vs T0. *P < 0.05, **P < 0.01. Comparing in the corresponding time points in differentgroup, ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01.M: Group Model; E: Group Electro-acupuncture.

表 1 两组不同时间血清T淋巴细胞亚群的比较 Table 1 Comparison of serum T cell subpopulations at different time points between the two groups (Mean±SD, n=6)

模型组及电针组IL-1水平在术后6、24、72 h较空白组均明显下降，在各相应时间点，模型组IL-1水平均明显低于电针组；模型组及电针组IL-6水平在术后6、24 h较空白组均明显升高，术后72 h电针组已降低，模型组仍升高，在术后6、72 h模型组IL-6水平均明显高于电针组（P < 0.05，表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 两组不同时间细胞因子的比较 Table 2 Comparison of cytokines at different time points between the two groups (Mean±SD, n=6) Indicators Group T0 T1 T2 T3 IL-1 (pg/mL) M 30.9±0.2 23.2±0.3▲ 20.1±0.2▲▲ 21.1±0.5▲▲ E 30.9±0.2 29.2±0.2▲◆ 26.8±0.1▲▲◆ 30.1±0.2▲◆◆ IL-6 (pg/mL) M 70.5±0.4 85.2±0.3▲▲ 76.3±0.5▲▲ 73.6±0.3▲ E 70.5±0.4 79.3±0.4▲▲◆ 75.3±0.1▲▲ 65.9±0.2▲◆ Comparing in same group, T1, T2, T3 vs T0. ▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01. Comparing in the corresponding time points in different group, ◆P < 0.05, ◆◆P < 0.01. M: Group Model; E: Group Electro-acupuncture,

表 2 两组不同时间细胞因子的比较 Table 2 Comparison of cytokines at different time points between the two groups (Mean±SD, n=6)

为了促进机体术后康复，如何保护机体的免疫功能是其中的关键，正是本课题研究的核心内容。本研究旨在探究一种医疗技术，此技术具有免疫调节作用，希望把这一医疗技术推广应用于临床，从而有效保护和调节机体术后免疫功能，加快术后的临床恢复。

有研究者^[9-11]观察针灸对大鼠细胞免疫功能的影响, 结果表明针灸可通过调节淋巴细胞保护机体的细胞免疫功能。也有研究^[12-13]证实电针刺激大鼠足三里穴，可调节机体的红细胞免疫功能。李建萍等^[14]观察得出针刺穴位可使血中皮质醇含量降低，脾脏中T、B淋巴细胞的活性增强，证实了针刺在体液免疫保护方面的作用^[15-16]。研究发现^[17-18]电针可能通过调节细胞因子之间的平衡而调节免疫系统的平衡, 提示针刺具有改善机体免疫抑制状态、促进免疫功能恢复、提高免疫应答水平的多向调节功能^[19-20]，可以调节许多细胞因子的水平，介导免疫细胞间的相互作用及免疫应答等多种生物学作用^[21]。我们有理由认为，电针技术可以通过对免疫细胞、免疫分子、细胞因子等系列影响，起到一种保护调节机体细胞免疫功能的作用。关于电针穴位可否调节手术麻醉后大鼠细胞免疫功能的实验研究，国内外尚未见类似文献的报道，因此，我们创新性的提出研究假设，把电针技术作用于麻醉手术后的大鼠，探究其免疫状态的改变，从而明确电针的免疫调节作用。

穴位的选择在本课题研究的重要问题，所选穴位首先必须是重要大穴，具有重要的疏导作用，可以发挥经络的整体调节作用，同时我们不能滥选穴位以避免不必要的干扰，最后我们还需进行优选穴位，以达到最好的研究结果。足三里穴是足阳明胃经之合穴，具有健运脾阳、培土化元、温中散寒、活血通络之功，足三里穴区微血管分支、神经分支及淋巴管分支十分丰富，电针刺激可使穴区微血管灌注量增加、神经及淋巴管的血液运行改善、功能增强，神经末梢兴奋性增高，启动神经-内分泌-免疫网络而实现电针的整体免疫调节，促进或增强机体的各种特异性和非特异性免疫功能^[22-23]，广泛影响机体的淋巴细胞和单核巨噬细胞系统的功能^[24-26]。曾有学者在针灸调节机体免疫功能的基础上作了腧穴相对特异性的研究^[27]，证实足三里穴在调节免疫功能的多项指标如淋巴细胞转化率、活性玫瑰花环形成率以及淋巴细胞活性等方面明显优于其它腧穴组^[28]。基于此，我们最终确定足三里穴作为我们研究所选的穴位。

本研究结果显示：（1）在各相应时间点，模型组CD3水平均明显低于电针组，其下降幅度明显大于电针组。由此可见，机体术后总体免疫功能是下降的，但非电针组下降程度明显更大，恢复时间明显更久。电针治疗后，免疫功能明显有所改善和恢复；（2）术后模型组CD4水平均低于电针组，下降幅度也大于电针组。机体术后的正向免疫保护机制是受到抑制的，但非电针组抑制程度明显更大，恢复时间更久。电针治疗后，正向的免疫保护机制明显有所恢复，提示了电针治疗改善免疫功能在正向途径方面的关键作用；（3）模型组及电针组CD8在术后较空白组均无明显变化，两组间各时间点水平差异也无统计学意义。由此可见，机体术后负向的免疫抑制机制无明显变化，电针治疗后，负向的免疫抑制机制也变化不大。进一步提示了电针治疗改善免疫功能是从正向途径方面起作用的；（4）模型组CD4/CD8术后较空白组明显下降，电针组则无明显变化，术后模型组及电针组CD4/CD8有明显差异，模型组低于电针组。由此可见，机体术后的免疫平衡是明显紊乱的，但电针治疗后，由于正向的免疫调节作用，免疫平衡得以维持基本正常，这可能是电针疗法保护术后免疫功能的重要机制。

最后，基于本课题主要研究机体的细胞免疫功能，因此所选实验指标也围绕细胞免疫而定。细胞因子是由免疫细胞释放的，在免疫细胞间起调节作用，在很大程度上反映了机体细胞免疫功能状态。IL-1、IL-6是与手术相关免疫抑制的关键因子^[29]，其相互平衡与否直接影响机体的免疫功能。T淋巴细胞亚群执行细胞免疫效应及免疫调节功能，在机体细胞免疫反应中有十分重要的地位，CD3、CD4、CD8是T细胞重要的表面抗原标志，广泛作为评估细胞免疫功能变化的标准。CD3（总T淋巴细胞）促进T淋巴细胞活化，释放的淋巴因子对病原微生物起着直接或间接的杀伤作用，CD3升高表明细胞免疫总体功能得到增强。CD4（辅助性T淋巴细胞）和CD8（抑制性T淋巴细胞）是一对相互制约的T细胞亚群，细胞免疫的自我稳定依赖于这对亚群间的平衡，CD4升高使产生淋巴因子、协助B淋巴细胞产生抗体及辅助其他淋巴细胞的功能增强，CD8的升高则提示机体的细胞免疫功能处于抑制状态。CD4/CD8比值反映体内T淋巴细胞亚群间的比例，更能反映机体的免疫状态，是监测细胞免疫功能，反映机体免疫状态的重要指标^[30]。我们以细胞免疫功能的研究作为研究手段，以反映机体的免疫状态。当中，T淋巴细胞亚群水平最能反应机体的细胞免疫状态，是判断细胞免疫水平的金标准。细胞因子与淋巴细胞重要相关，两者互为影响。把T淋巴细胞及其相关因子结合研究，可以更全面的明确机体的免疫功能，使本研究结果更有说服力。

综上所述，术后电针组细胞免疫功能的抑制程度明显较模型组轻，且恢复较模型组快，差异有显著性，表明实验大鼠在麻醉手术后T细胞免疫功能受到破坏，电针的应用，由于正向的免疫调节机制，有效保护T细胞免疫功能，免疫平衡得以维持，从而对麻醉手术后大鼠的细胞免疫功能具有一定的保护作用。本研究的成功，可把电针技术应用于临床围术期，可产生预期的免疫保护与调节作用，有利于患者术后的康复。