2018, Vol. 38
2. 苏州大学第一附属医院血液科，江苏 苏州 215006
2. Department of Hematology, First Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215006, China
Leupaxin（LPXN）是1998年Lipsky等[1]从人的巨噬细胞cDNA文库中成功克隆出的一个桩蛋白（paxillin）家族新成员，主要表达于白血病、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤细胞的胞浆[2-3]。LPXN常定位于黏着斑（FAP），构成细胞与细胞基质局部粘附的关键部位，同时也是细胞信号转导的重要位点，参与调节细胞的增殖与分化，调控肿瘤细胞的粘附与迁移[4-7]。目前，LPXN在肿瘤疾病中的研究主要集中于前列腺癌。比如国外有研究发现：LPXN在具有较强侵袭力的前列腺癌PC-3及DU 145细胞中表达很高，而在非侵袭性前列腺癌LNCaP细胞中表达很低；在这些细胞中，LPXN与actin、paxillin等主要聚集于FAP，与蛋白激酶FAK、PYK2、c-Src、蛋白磷酸酶PTP-PEST等相互作用后激活RAS-MAPK、PI3K/Akt、STAT1、P53、GTPase等下游通路，从而促进前列腺癌细胞的增殖、粘附与侵袭；通过RNA干扰下调LPXN的表达，促使前列腺癌细胞相互分离与自发凋亡，降低肿瘤细胞的增殖和侵袭[8-13]。
人们对于LPXN与白血病之间的研究也日益关注，但国内外迄今为止也仅有5例报道。其中Petti[14]、Tanaka等[15]发现LPXN通过表达水平的高低、磷酸化的改变影响白血病细胞株HMC-1、K562及TPH-1 [16]细胞的粘附、侵袭与迁移；戴海萍[17]及Abe等[18]均发现LPXN参与急性白血病相关染色体易位，促进急性白血病的发生和发展。在本课题组的前期研究中，我们发现（6.25~ 25）μmol姜黄素（Curcumin，Cur）或(0~2.0) μmol阿糖胞苷（Ara-C）均可通过激活磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（p-MAPK）从而呈剂量依赖性抑制AML-5b型人急性单核细胞白血病细胞株SHI-1的体外增殖并诱导细胞凋亡[19]；且在Cur药物体外作用SHI-1细胞时，下调了桩蛋白LPXN的表达。考虑人急性单核细胞白血病SHI-1细胞的多药耐药、高增殖、高恶性、高表达LPXN蛋白等特点[20]，本研究拟进一步通过siRNA转染干扰下调LPXN分子表达并联合Cur或Ara-C药物，国内外首次探讨LPXN表达下调后对急性白血病SHI-1细胞的体外增殖以及细胞对常见治疗药物敏感性的改变，为临床探究急性白血病的药物治疗机制、寻求新的药物作用靶点提供实验依据。
1 材料和方法 1.1 主要材料SHI-1细胞株由江苏省血液病研究所惠赠；Cur（Sigma-Aldrich）；一抗p-MAPKs，LPXN（Cell Signaling, Santa Cruz）；LipofectamineTM2000转染试剂盒（Invitrogen）；CCK-8试剂盒（同仁）；小干扰RNA（siRNA）均由上海Genepharma公司合成。
1.2 细胞培养SHI-1细胞用含15% FBS的IMDM培养液于37 ℃、5% CO2饱和度的细胞培养箱中进行培养，2~3 d传代1次。
1.3 小干扰RNA (siRNA)转染SHI-1细胞用RNAi技术特异性沉默SHI-1细胞中LPXN的表达，针对LPXN基因的siRNA序列参照文献[22]由Genepharma公司合成如下两对：L1-siRNA（正义链5'-UAUUCCAACCCAGCUCCUC-3'，反义链5'-GAGGAGCUGGGUUGGAAUA-3'）和L2-siRNA（正义链5'-GGCGCAGCUCGUGUAUACUACCAAU-3'，反义链5'-AUUGGUAGUAUACACGAGCUGCGCC-3'）。另合成针对荧光素酶基因的siRNA序列（后续简写为N-siRNA）作为转染的阴性对照，合成荧光标记的FAMsiRNA序列作为转染的阳性对照。各对siRNA序列经LipofectamineTM2000转染入SHI-1细胞，具体实验操作参照试剂说明书并作适当修改，比如为了提高siRNA的转染效率，在siRNA转染SHI-1细胞前后，改用无血清Opti-MEM® I培养液洗涤、重悬和继续培养转染后的SHI-1细胞，并如转染后3 h添加15% FBS。
1.4 流式细胞仪（FCM）检测siRNA对SHI-1细胞的转染效率参照苏州大学王春玲博士、冯洒然博士利用脂质体LipofectamineTM2000将目的基因siRNA成功转染入SHI-1悬浮细胞的转染条件[23-24]，本研究同样利用LipofectamineTM2000将阳性对照组中羧基荧光素标记的不同浓度FAM-siRNA和阴性对照组中的NsiRNA分别于24孔板中转染SHI-1细胞。收集每孔转染并培养12 h后的SHI-1细胞，用PBS洗涤2遍后经FCM检测siRNA转染效率，用来筛选和优化后续转染条件。
1.5 Western blot法检测LPXN-siRNA的干扰效果按照上述FCM检测结果，确定siRNA / LipofectamineTM2000的最佳混合比例以及合适细胞接种密度，并严格按照此转染条件将干扰LPXN表达的两种不同siRNA序列L1-siRNA与L2-siRNA，以及阴性对照N-siRNA分别转染SHI-1细胞。收集转染48 h后的各组SHI-1细胞，Western blot检测siRNA对SHI-1细胞中LPXN表达的影响，筛选有效干扰LPXN表达的siRNA序列进行后续研究。
1.6 CCK-8观察LPXN-siRNA对SHI-1细胞增殖以及药物敏感性的影响取对数生长期SHI-1细胞并以4×105/mL密度接种96孔板，同时设立不加细胞的空白对照组；稀释筛选出的能有效干扰LPXN表达的L2-siRNA以及阴性对照N-siRNA，分别转染SHI-1细胞；转染并培养24 h后，分别向每组细胞中加入不同浓度的Cur（终浓度分别为6.25、12.5、25 μmol）或Ara-C（终浓度分别为1.0、1.5、2.0 μmol），轻轻混匀后继续孵育24 h；再向每个培养孔内加入10 μLCCK8试剂，37 ℃继续孵育3 h，酶标仪读取450 nm波长下的吸光度（A）。
1.7 Western blot法检测LPXN-siRNA转染后SHI-1细胞中p-MAPK的表达将L2-siRNA及N-siRNA分别转染SHI-1细胞，培养24 h后加入不同浓度Cur或Ara-c，继续培养48 h。收集各组转染siRNA后又加入药物Cur或Ara-c的SHI-1细胞，按照Western blot操作步骤，检测细胞中p-JNK、p-P38 MAPK及p-ERK的表达，探究LPXN-siRNA影响SHI-1细胞增殖及药物敏感性的可能分子机制。
1.8 统计学方法实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 15统计软件进行处理，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 FCM检测FAM-siRNA对SHI-1细胞的转染效率在SHI-1细胞采用4 × 105/mL接种密度，FAM-siRNA/LipofectamineTM2000=200 pmol/1 μL的混合比例条件下达到了最高转染效率74.5%，因此后续目的基因LPXN siRNA均按照此筛选条件进行SHI-1细胞的转染（图 1）。
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图 1 流式细胞仪（FCM）检测FAM-siRNA对SHI-1细胞的转染效率 Figure 1 Transfection efficiency of FAM-siRNA in SHI-1 cells detected by flow cytometry. A: N-siRNA/Lip2000=200 pmol/1 μL; B: FAMsiRNA/Lip2000=100 pmol/1 μL; C: FAM-siRNA/Lip2000=200 pmol/1 μL. |
L1-siRNA转染组的1、2泳道与N-siRNA转染对照组的3、4泳道相比，LPXN蛋白表达基本无变化，提示L1-siRNA对LPXN蛋白表达无干扰效果（图 2）。L2-siRNA转染组的5、6泳道与N-siRNA转染对照组的3、4泳道相比，LPXN蛋白的表达均发生了下降，尤其是第5泳道中当L2-siRNA/Lip2000=200 pmol/1 µL混合比例时LPXN蛋白的表达下降更为明显，提示L2-siRNA对LPXN表达具有一定干扰效果。尤其当L2-siRNA/Lip2000=200 pmol/1 µL混合比例时达到更佳干扰效果，这和2.1中FCM检测结论相一致。因此后续实验中，我们仅选择L2-siRNA序列，按照L2- siRNA/Lip2000=200 pmol/1 µL的最佳比例进行转染和研究。
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图 2 Western blot法检测两种不同的siRNA序列对SHI-1细胞中LPXN的干扰效应 Figure 2 LPXN-silencing effects of two different siRNA sequences detected by Western blotting in SHI-1 cells. 1:L1-siRNA/Lip2000=200 pmol/1 µL; 2: L1-siRNA/ Lip2000=100 pmol/1 µL; 3: N-siRNA/Lip2000=200 pmol/1 µL; 4: N-siRNA/Lip2000=100 pmol/1 µL; 5: L2- siRNA/Lip2000=200 pmol/1 µL; 6: L2-siRNA/Lip2000= 100 pmol/1 µL. |
在不添加任何药物的情况下，N-siRNA转染组细胞的增殖抑制率为8.247±1.003，L2-siRNA转染组SHI-1细胞的增殖抑制率为27.043±2.051，表明L2-siRNA转染下调LPXN表达后在一定程度上抑制了SHI-1细胞的增殖（P < 0.05，图 3）。
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图 3 CCK-8检测不同浓度Ara-C、Cur对L2-siRNA及N-siRNA两转染组中SHI-1细胞的增殖抑制率 Figure 3 Proliferation inhibition rates of LPXN-siRNA, Ara-C and Cur detected by CCK-8 reagent in SHI-1 cells. A: 0-2.0 μmol Ara-C group; B: 0-25 μmol Cur group. |
各浓度Ara-C分别作用N-siRNA及L2-siRNA两转染组相等时间后，L2-siRNA转染组细胞的增殖抑制率均高于N-siRNA转染组（P < 0.05，图 3A）。各浓度Cur作用两转染组相等时间后，L2-siRNA转染组SHI-1细胞的增殖抑制率均高于N-siRNA转染组。尤其是在Cur 6.25 μmol及Cur 12.5 μmol药物组，L2-siRNA转染组的细胞增殖抑制率均明显高于NsiRNA转染组（P < 0.05，图 3B）。
2.4 LPXN通过激活MAPK影响SHI-1细胞的增殖和药物敏感性第1~3泳道为未加任何药物组，其中第3泳道L2- siRNA转染组的p-JNK与p-P38MAPK，均比第1泳道仅加SHI-1细胞的空白对照组和第2泳道N-siRNA阴性转染组表达增高；而p-ERK在这3组中的表达均不变。
第4~7泳道均为转染siRNA后的加药组。其中第5泳道添加Cur药物的L2-siRNA转染组中p-JNK与p-P38 MAPK的表达分别比第4泳道N-siRNA对照组增高；同样，第7泳道添加Ara药物的L2-siRNA转染组中p-JNK与p-P38 MAPK的表达也分别比第6泳道对照组增高。而p-ERK在同样药物作用的两转染组中表达变化不大（图 4）。
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图 4 Western blot检测L2-siRNA及N-siRNA两转染组添加Ara-C或Cur 48 h后SHI-1细胞内p-MAPK蛋白的表达 Figure 4 Expression of p-MAPK detected by Western blotting in SHI-1 cells 48 h after transfection with N-siRNA and L2-siRNA. 1: SHI-1 cell blank group; 2: N-siRNA transfection group; 3: L2- siRNA transfection group; 4 : N-siRNA transfection group with 12.5 μmol Cur; 5: L2-siRNA transfection group with 12.5 μmol Cur; 6 : N-siRNA transfection group with 1.5 μmol Ara-C; 7: L2- siRNAtransfection group with 1.5 μmol Ara-C. |
SHI-1细胞株是2002年由苏州大学、江苏省血液病研究所、江苏省免疫所共同培养与建立的国内第1株且国际第3株的人急性单核细胞白血病细胞系（AML-5b型），后经陈苏宁博士鉴定，该细胞株伴有特异的t（6; 11）（q27: q23）染色体易位，存在MLL-AF6融合基因，且经体外培养存在着多药耐药，其中对对足叶乙甙（VP16）最为明显；另高表达桩蛋白LPXN，具有高恶性、高增殖、强耐药等特性，因此是一个很有价值的白血病研究模型[20, 24]。结合我们前期研究中发现Cur药物通过p-MAPK激活、下调LPXN表达等影响SHI-1细胞的增殖和凋亡[19]，本研究中我们首次尝试筛选有效siRNA序列干扰桩蛋白LPXN的表达，并观察LPXN表达下调后对SHI-1细胞增殖与药物敏感性的影响。我们通过带有荧光标记的FAM-siRNA，反复实验摸索出siRNA转染入SHI-1悬浮细胞的最佳转染条件为细胞密度4×105/mL时将siRNA/ LipofectamineTM2000混合比例配置为200 pmol/1 μL进行转染，可达到最高74.5%的转染效率，这与王春玲等[23]将MMP-2 siRNA转染入SHI-1细胞的转染结果基本一致。在后续目的基因LPXN-siRNA转染SHI-1细胞的研究中，我们均严格按照此转染条件进行，并通过Western blot筛选出L2-siRNA是一定程度上可干扰下调SHI-1细胞中LPXN蛋白表达的有效序列。
通过CCK-8试剂检测，我们发现L2-siRNA转染组在下调LPXN表达后一定程度上抑制了SHI-1细胞的增殖（P < 0.05），表明在SHI-1细胞中降低LPXN蛋白的表达能减弱白血病细胞的恶性增殖，通过RNA干扰下调LPXN的表达，促使前列腺癌细胞相互分离与自发凋亡，降低肿瘤细胞的增殖结论相一致[9-11]。进一步添加不同浓度Ara-C或Cur药物进入N-siRNA及L2-siRNA两转染组，我们还可看出L2-siRNA干扰下调LPXN表达后增强了该两种药物对SHI-1细胞的增殖抑制性，即在相同培养条件下，LPXN蛋白表达降低能进一步增强SHI-1细胞对Ara-C或Cur药物的敏感性，为临床改善该类型白血病病人的多药耐药提供了新的治疗思路。
本研究为进一步探讨LPXN蛋白表达下调后抑制SHI-1细胞增殖，增强其药物敏感性的可能分子机制，并参考其他对前列腺癌中LPXN分子参与的信号通路的研究结果[8-13]，Western blot检测siRNA转染后SHI-1细胞内p-MAPK的表达。MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，大量研究表明MAPK家族的3个成员ERK、JNK和P38 MAPK磷酸化激活后参与细胞凋亡信号通路转导，调控肿瘤细胞的增殖、凋亡及分化[25-29]。结果在本研究LPXN表达下调后的L2-siRNA转染组p-JNK和p-P38 MAPK的表达均增加，而p-ERK的表达水平则与阴性对照组基本一致。表明L2-siRNA转染组在干扰下调LPXN表达后可能通过激活JNK和P38 MAPK，从而在一定程度上抑制SHI-1细胞的增殖，增强SHI-1细胞对Cur及Ara-C药物的敏感性。MAPK家族的ERK分子则与该过程可能无关。
总之，本研究成功筛选出能干扰下调桩蛋白LPXN表达的siRNA序列，并以较高效率转染入人急性单核白血病SHI-1细胞。我们发现siRNA干扰下调LPXN表达后不仅一定程度上抑制了SHI-1细胞的增殖，而且增强了相同培养条件下SHI-1细胞对Cur及Ara-C药物的敏感性；且相关分子机制可能与LPXN蛋白表达下调后激活MAPK家族的JNK及P38 MAPK蛋白酶有关。
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