骨性关节炎（OA）是最普遍的慢性关节疾病，近期研究表明中国45岁以上人群中有症状骨性关节炎患者占8.1% ^[1-2]，随着人口老龄化这一比例还将增大。OA最常累及髋、膝、指间关节，表现为关节疼痛和活动障碍，以关节活动严重受限和人工关节置换为结局^[3-4]，严重降低患者生活质量并产生高额的医疗开销。

OA的病理改变以软骨退变为主，成年的关节软骨为无血管组织，且软骨细胞仅占总体积5%，因此软骨损伤一旦发生难以自发修复^[5-6]。目前临床上OA的非手术治疗方式以控制症状为主，尚不能有效延缓病理发展。口服对乙酰氨基酚或NSAIDs类药物能缓解轻中度疼痛，但不能延缓或逆转关节软骨退变的结局，且部分药物具有一定肝毒性或易出现胃肠反应，因此不宜长期服用^[7-8]。关节腔注射糖皮质激素能缓解口服药物无法控制的中、重度关节痛，但长期疗效较安慰剂并无明显差异^[9]，富血小板血浆（PRP）因制备方式不同而疗效差异大^[10-11]。

转化生长因子β家族（TGFβs）被认为是维持关节稳态，防止软骨细胞退变，促进软骨组织再生的重要生长因子^[12-14]。然而直接向关节腔注射外源性TGFβ耗费巨大，且浓度过高会增加骨赘形成风险^[15]。TGFβs在人体微环境包括关节组织内以一种潜伏形式富集（latentTGFβs），在人类滑膜液中检测到平均1.84 ng/mL的latent-TGFβ1，软骨基质中也有平均68.5 ng/mL的latent-TGFβ1 ^[16-17]。因此将内源性Latent-TGFβ1激活至治疗浓度，从而延缓软骨退变是有可能的。

抗坏血酸（AA）是一种还原性维生素，细胞学实验证实AA能有效降低软骨细胞受到的氧化应激损伤^[18]。此外AA可与氯化铁（FeCl₃）通过芬顿化学反应产生低毒性过氧化物从而激活latent-TGFβ1 ^[19]。其他研究发现对碘酸盐诱导的OA大鼠每日喂食AA100 mg/kg能延缓其关节软骨退变^[20]。然而长期口服治疗量的AA可能引起胃肠反应，血色素沉着症甚至尿路结石^[21-22]。以手术方式增加关节不稳定性而建立的大鼠模型是研究OA药物的重要工具。其中前交叉韧带横断联合内侧半月板摘除（ACLT/pMM）因成功率高，不直接损伤关节软骨，造模周期短而被广泛应用^[21-22]。目前尚无研究探索关节腔注射AA/FeCl₃混合剂对任何OA模型包括ACLT/pMM大鼠的关节退变的影响。综上所述我们提出假设，关节腔注射AA/FeCl₃能激活滑膜液和软骨基质中内源性latent-TGFβ1，使其达到治疗浓度。同时抗坏血酸可保护软骨细胞，减轻氧化应激损伤，最终延缓关节软骨退变。本实验通过观察ACLT/pMM大鼠关节腔注射AA/FeCl₃后的关节退变情况验证上述假设。

本实验选用30只SPF级雄性Wistar大鼠，10~12周龄，体质量300~350 g（南方医科大学南方医院实验动物中心提供）。

大鼠购回后适应饲养环境1周。术前称重，按体质量予腹腔注射3%戊巴比妥（1 mL/kg），联合左后肢肌注速眠新注射液（0.1 mL/kg）。观察角膜反射、趾反射，消失后进行右后肢备皮，碘伏-酒精消毒，铺无菌手术单（图 1A）。手术方式采用改良Hulth法^[23]。沿右膝关节髌腱内缘依次切开皮肤、筋膜、肌腱，向外侧脱位髌骨。屈曲膝关节暴露关节腔，直视下剪断前交叉韧带，前抽屉实验阳性后摘除内侧半月板（图 1B）。术毕逐层缝合切口，酒精消毒切口及周围皮肤（图 1C）。术后大鼠被随机分入生理盐水对照组和AA/FeCl₃实验组，每组15只。

图 1(Figure 1)

图 1 动物手术和关节腔注射 Figure 1 Surgical procedure and intra-articular injection. A: Disinfection; B: Exposure and disconnection of the anterior cruciate ligament; C: Medial meniscus; D: Intraarticular injection.

术后第3周末开始，在戊巴比妥麻醉下按体质量对实验组大鼠关节腔注射AA/FeCl₃混合液（0.3 mL/kg）每周1次，对照组注射生理盐水。具体做法由右膝髌骨外上方向关节腔进针，感受到镂空感后立即推注，注射完毕活动关节。AA/FeCl₃混合液成分为AA 2 mmol/L，FeCl₃ 200 μmol/L，溶解于注射用生理盐水，配制后0.5 h内注射。AA和FeCl₃从美国SIGMA购买。

术后第6、9、12周末，各组分别随机选取5只大鼠，以戊巴比妥麻醉后送至南方医科大学南方医院影像科，进行右膝曲屈位摄片观察关节面及软骨下骨改变。

拍摄X线后在麻醉下以颈椎脱臼法处死大鼠。剥离皮肤肌肉，将右侧膝关节从股骨髁上1 cm至胫骨平台下1 cm完整取下，小心暴露关节腔，剔除剩余肌肉组织。PBS冲洗标本2次，拍摄关节面情况。所有标本被置于4%多聚甲醛中固定48 h，随后用0.5 mol/L EDTA脱钙4周。脱钙结束将标本依次浸入60%、70%、80%乙醇、正丁醇，各4 h。脱水完成后进行常规石蜡包块制作，最终以5 μm厚度在缺损最严重部位连续切片。

切片脱蜡、复水后依次浸染铁苏木素5 min，0.02%固绿1 min，1%冰醋酸30 s，1%番红30 min，随后脱水、透明、封片。基于番红O/固绿染色切片，使用国际骨关节炎研究协会OARSI推荐方法（总分0~24）对软骨退变进行评估^[24-25]。简单来说是将内侧胫骨平台软骨损伤深度和范围分别划分为6和4个等级，级数相乘即为得分，每个样本由3位观察者独立评分后取均值。

切片脱蜡、复水、抗原修复后，在4 ℃环境中敷大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体（Santa Cruz）14~18 h。次日将切片复温，并按说明书操作DAB免疫组化试剂盒（R & D system），结束后脱水封片。使用Image Pro Plus 6.0软件计算内侧胫骨平台软骨层的累计阳性积分IOD，以及检测区域面积Area，以IOD/Area代表Ⅱ型胶原阳性程度。

所有数据经SPSS 21.0软件分析，首先进行方差齐性和正态性检验，再使用单因素方差分析进行组间比较，方差齐用LSD检验，不齐用DunnettT3检验，P < 0.05认为差异具有统计学意义。文中数据表述为均值±标准差。

所有大鼠造模术后2 h苏醒，次日反应、进食良好，切口未见异常，右膝关节稍肿胀。术后第3天肿胀消失，大鼠步态恢复正常，术后第14天切口基本愈合。每次关节腔注射后0.5 h大鼠苏醒，次日右后肢能正常活动，所有大鼠未出现明显关节感染。

屈曲位X线检查显示，生理盐水对照组和AA/ FeCl₃实验组6周时均无明显改变（图 2A、D）。9周时对照组关节面不平整，可见骨赘，部分大鼠出现脱位。实验组仍未见明显骨关节炎改变（图 2B、E）。两组晚期样本均出现关节线消失，骨赘形成（图 2C、F）。

图 2(Figure 2)

图 2 各组大鼠右膝曲屈位X线影像 Figure 2 X-ray films of the right knee (Scale bar=10 mm). A-C: Saline group at 6th, 9th, and 12th weeks, respectively; D-F: AA/FeCl3 group.

6周时2组内侧关节面均光滑完整（图 3A、D）。9周时对照组股骨内髁出现小面积软骨溃疡（箭头所示），内侧胫骨平台表面粗糙；实验组内侧胫骨平台表面粗糙，未见明显缺损（图 3B、E）。12周时对照组内侧股骨髁、内侧胫骨平台均出现软骨缺损，深及骨板，外侧关节面粗糙；实验组胫骨平台出现明显溃疡（图 3C、F）。

图 3(Figure 3)

图 3 各组大鼠右膝标本 Figure 3 Right knee joint samples (Scale bar=5 mm). A-C: Saline group at 6th, 9th, and 12th weeks, respectively; D-F: AA/FeCl3 group. Black arrows indicate cartilage defects.

番红O染色图片可见，6周时对照组内侧胫骨平台出现深及中层软骨的小范围缺损（15%~20%）；实验组内侧胫骨平台表层软骨缺损，面积约30%~50%（图 4A、D）。9周时对照组内侧胫骨平台软骨缺损达到深层软骨，面积60%~80%；实验组缺损伤及中层软骨，面积约50%（图 4B、E）。晚期两组均有大面积缺损，对照组深至钙化软骨层，实验组波及深层软骨（图 4C、F）。9周和12周时实验组OARSI评分显著低于对照组（6周18.67±0.67 vs 12.17±2.75，P < 0.05；12周20.11±1.83 vs 13.77±0.40，P < 0.05）。

图 4(Figure 4)

图 4 番红O/固绿染色与OARSI评分 Figure 4 Safranin-O/Fast green staining and OARSI scores. A-C: Safranin-O/Fast green staining of saline group at 6th, 9th, 12th weeks. D-F: AA/FeCl3 group. Scale bar=100 μm. G: OARSI scores of each group (*P < 0.05).

相比实验组，第6、9周对照组胫骨平台软骨层Ⅱ型胶原丢失明显，12周时两组无明显区别（图 5A~F）。半定量结果示6、9周两组间单位软骨面积内Ⅱ型胶原含量有显著差异，实验组多于对照组（6周0.366±0.039 vs 0.493±0.029，P < 0.05；9周0.256±0.041 vs 0.382±0.040，P < 0.05）。

图 5(Figure 5)

图 5 二型胶原染色与半定量分析 Figure 5 Immunohistochemistry of collagen type Ⅱ. A-C: Saline group at 6th, 9th, 12th weeks. D-F: AA/FeCl3 group. (Scale bar=100 μm). G: Semi-quantitative results (*P < 0.05)

OA的一般病理改变为关节软骨退变（软骨细胞凋亡增加，细胞外基质丢失，软骨表面纤维化），关节边缘骨赘形成，软骨下骨吸收-重构紊乱^[26-27]。高龄、关节创伤、肥胖和遗传易感性都被证实是OA的危险因素。OA的分子机制非常复杂，TGFβ1信号通路在OA中有着多重作用。构建了一种关节软骨细胞（AC）特异性的TGFβRⅡ基因敲除鼠，并发现这些小鼠AC高表达OA相关基因如Runx2、Mmp13、Col10以及Adamts5，最终导致自发性OA ^[28]。在体外利用慢病毒转染使关节软骨细胞高表达TGFβ1蛋白，随后筛选表达稳定且免疫原性低的细胞移植入软骨缺损来治疗OA，目前该治疗技术及产品已通过FDA临床Ⅲ期试验^[29]。这些研究表明TGFβ通路能维持AC稳态，延缓软骨退变。而另一方面发现激活ACLT小鼠软骨下骨中骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的TGFβ1通路促进骨赘形成，相反抑制该通路能减轻OA的软骨下骨紊乱^[30]。可见TGFβ通路在OA中的作用是多重的，TGFβ相关的OA治疗应该针对特异的靶器官或细胞。在本实验中，治疗的起始时间为术后第3周，软骨的退变仍处于非常早期的状态，软骨厚度无显著改变（图 4A、E），因此AA/FeCl₃主要激活范围为软骨层，激活软骨层TGFβ通路延缓OA是可能的（图 4G）。另一方面，6周、9周实验组X线影像并未见明显骨改变（图 2D、E），相反对照组可见骨赘形成（图 2B），侧面反映了AA/FeCl₃激活范围是安全的。如果以9周、12周为起始点进行治疗，混合液激活范围深至软骨下骨，那么加重软骨下骨紊乱是有可能的，但这需要进一步实验探索。

AA作为还原性维生素对软骨细胞氧化损伤有很好的保护作用^[18]，有研究表明口服AA有预防OA软骨退变的作用^{[20, 31]}。然而也有学者指出口服AA不能有效预防OA。对几内亚猪喂食AA（2.5~150 mg/d），发现喂食后自发性OA严重程度与计量正相关，并且在新生的骨赘中观察到活性TGFβ1富集^[32]。对膝关节创伤患者进行跟踪研究发现，血清高浓度AA是发展为影像学OA的危险因素^[33]。这些研究表明口服AA对OA的预防效果并不明确，相反有可能促进关节内骨赘形成，其原因可能与广泛的激活了TGFβ通路有关。在本研究中，关节腔注射的AA总量非常低（0.117 mg/kg），但因为在关节腔内直接接触软骨组织，因此对Latent TGFβ1及其通路的激活更加特异和高效，避免因全身用药引起的不良反应。

成年关节软骨的主要细胞外基质成分是胶原，尤其是Ⅱ型和Ⅲ型，它们很好的维持了软骨弹性。OA软骨退变时Ⅱ型胶原减少，X型胶原增多，提示软骨细胞终末分化。AA可通过调节转录因子SVCT2，提高Ⅱ型胶原在关节软骨细胞的转录和转录后表达水平^[34]。我们的研究也发现，直接关节腔注射AA能显著降低OA大鼠软骨中Ⅱ型胶原丢失，尤其在早、中期（图 5）。

虽然本实验观察到AA/FeCl₃混合液能延缓ACLT/ pMM模型大鼠的软骨退变，但在转化应用前还有许多问题需要阐明。在未来研究中我们将深入探索该治疗涉及的分子机制，从而获得更加安全有效的成分配比，尝试其他OA造模方法，并在大动物关节内进行验证。同时将细化不同阶段OA对该混合液的反应，并将软骨下骨和滑膜的改变纳入观察范围。