根据中国疾病预防控制中心和瑞金医院于2010年全国糖尿病调查项目显示，中国18岁及以上成人糖尿病患病率已达11.6%，其中90%以上为2 型糖尿病（T2DM）^[1]。糖尿病血管病变是糖尿病最常见的并发症之一，严重威胁人类生存质量及生命安全。胰高血糖素样肽1（GLP-1）作为一种由肠道内分泌L细胞分泌的肠肽激素，可以抑制胰高血糖素和胃肠道激素的分泌，具有良好的降糖作用^[2]。此外，在我们课题组的前期研究中发现，GLP-1 可以抑制由糖基化终末产物（AGEs）诱导的血管内皮细胞凋亡^[2]。但GLP-1保护血管内皮细胞的具体机制尚未完全明了。丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）属于丝蛋白/苏氨酸激酶，p38MAPK信号通路为MAPK家族的重要成员，该通路参与巨噬细胞、嗜中性粒细胞的功能性反应，包括粘附和凋亡等^[3]。国内外有研究表明，p38MAPK信号通道可以调影响内皮细胞功能异常^[4]。为了明确GLP-1保护血管内皮细胞与p38MAPK之间的关系，本课题组建立AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤为研究模型，初步探讨p38MAPK信号通道在GLP-1 抗血管内皮损伤中的作用机制，现报道如下。

兔抗人vWF多克隆抗体（美国SANTA CRUZ公司），山羊抗兔IgG抗体（R&D），异硫氢酸荧光素标记的羊抗兔多克隆抗体（Sigma），Annexin V/PI 检测试剂盒（中国宝赛生物技术公司），GLP-1（7-36）a（Sigma），p3MAPK 抑制剂（SB203580）（Selleck），抗鼠p-P38MAPK单克隆抗体、抗鼠p38MAPK 多克隆抗体（SANTA CRUZ），荧光显微镜（Nikon eclipseTe2000u），流式细胞仪、酶标仪（BIO-RAD）。

HUVECs的分离、培养及鉴定具体步骤参考本课题组前期研究^[5]。

AGEs的制备及鉴定具体步骤参考Horiuchi等实验方法^[6]。

细胞培养结束后收集细胞，转移至离心管，冰浴下，使细胞充分裂解（裂解液中，PMSF工作浓度为1 mmol/L），离心取上清。蛋白质浓度测定采用BCA法，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作测定。取等量蛋白与2× 上样缓冲液混合煮沸5 min 后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜后放入10%脱脂奶粉封闭液中，封闭2 h；PBST洗膜后，先后加一抗鼠p-p38MAPK或抗eNOS单克隆抗体（1∶1000抗单克隆抗体），反应1.5 h，加1∶3000辣根过氧化物酶标记二抗，反应1 h，PBST洗膜，ECL法显影，结果经Image J图象分析系统对目的条带进行分析，以各组细胞p-p38MAPK或eNOS 蛋白表达与内参α-Tubulin 表达的比值作为p-p38MAPK 或内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）蛋白表达水平。

抑制剂预处理1 h 后加入GLP-1，30 min 后加入AGEs，在37 ℃，5%CO₂条件下培养24 h。24 h后胰酶消化细胞，800 r/min离心4 min，随后加入预冷的无菌PBS洗2次。再次离心后吸尽残留的PBS，轻轻振荡细胞悬液30 s，使之均匀。随后按Annexin V/PI凋亡试剂盒说明进行操作。

数据采用SPSS19.0进行统计分析，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单向方差分析（One-WayANOVA）检验，两两比较采用LSD法。P＜0.05具有统计学意义。

p-p38MAPK及总t-p38MAPK蛋白量表达水平采用灰度值校正值显示（各条带灰度值/相对应的内参α-Tubulin灰度值，标注的A、B、C、D分别为Control组、AGEs组、GLP-1 组及AGEs+GLP-1 组），结果如图 1。方差分析显示，给予不同处理后，多组间p-p38 MAPK蛋白表达具有差异（F=56.989,P＜0.001），差异有统计学意义；而t-p38 MAPK蛋白表达无统计学差异（F=0.568,P=0.652）。进一步两两比较后显示，与对照相比较，单独加入AGEs或GLP-1可分别导致p-p38MAPK蛋白表达水平上升（P=0.001）或下降（P＜0.001），差异有统计学意义；而予以AGEs 及GLP-1 共同处理后，其p-p38MAPK蛋白量水平较AGEs单独处理组下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图 1(Figure 1)

图 1 GLP-1对AGEs处理下细胞磷酸化p38MAPK及p38MAPK蛋白表达的影响 Figure 1 Effects of GLP-1 and AGEs on protein expression of p-p38MAPK and p38MAPK. *P<0.05 vs control group.

p-eNOS 及t-eNOS 蛋白量表达水平采用灰度值校正值显示（各条带灰度值/相对应的内参灰度值，标注的A、B、C、D、E 分别为Control 组、AGEs 组、AGEs+ GLP-1 组、AGEs + SB203580、AGEs + GLP-1 +SB203580），结果如图 2。多重比较显示，各组给予不同处理后，组间p-eNOS 蛋白表达具有差异（F=6.645,P=0.007），差异有统计学意义；而t-eNOS 蛋白表达无统计学差异（F=1.677,P=0.231）。进一步两两比较后显示，与对照组比较，AGEs可降低p-eNOS 表达水平（P=0.007），差异有统计学意义；而予以GLP-1 或p38MAPK 抑制剂（SB203580）预处理后，受抑制的p-eNOS 蛋白表达水平再次升高（P=0.004，P=0.011），差异有统计学意义；在AGEs+GLP-1组予以SB203580预处理前后，eNOS磷酸化蛋白表达水平差异无统计学意义（P=0.273）。

图 2(Figure 2)

图 2 P38MAPK抑制剂及GLP-1对AGEs处理下细胞磷酸化eNOS及eNOS蛋白表达的影响 Figure 2 Effects of P38MAPK inhibitor and GLP-1 on the protein expression of p-eNOS and t-eNOS induced by AGEs. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs AGEs-induced group.

Annexin V/PI双染色后经流式细胞仪检测细胞凋亡率，如图 3、表 1。方差分析显示，各组间差异具有统计学意义（F=40.142,P＜0.001）。多重比较显示，与阴性对照组相比，AGEs 可诱导细胞凋亡率增高（P＜0.001），差异有统计学意义；而GLP-1单独处理对内皮细胞凋亡率无明显影响（P=0.234）；在AGEs 组加入SB203580 或GLP-1 预处理后，AGEs诱导的细胞凋亡率均下降（P＜0.001，P＜0.001），差异有统计学意义；而在AGEs+GLP-1组加入p38MAPK抑制剂前后，细胞凋亡率变化无统计学意义（P=0.085）。

图 3(Figure 3)

图 3 p38 MAPK抑制剂及GLP-1对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响 Figure 3 Flow cytometric analysis of apoptosis of HUVECs treated by negative control (A), AGEs (B), GLP-1(C), AGEs+GLP-1(D), AGEs+SB203580(E), and AGEs+GLP-1+SB203580 (F).

表 1(Table 1)

表 1 p38 MAPK抑制剂及GLP-1对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响 Table 1 Effects of p38 MAPK inhibitor and GLP-1 on HUVEC apoptosis induced by AGEs (n=3) Group Apoptosis (%) F P Control 6.17±0.67 40.142 0.000 AGEs 20.63±2.87* GLP-1 4.50±0.26 AGEs+GLP-1 6.97±0.71# AGEs+SB203580 10.17±1.50# AGEs+GLP-1+SB203580 5.87±2.35 *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs group AGEs.

表 1 p38 MAPK抑制剂及GLP-1对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响 Table 1 Effects of p38 MAPK inhibitor and GLP-1 on HUVEC apoptosis induced by AGEs (n=3)

在人体处于高糖状态下，AGEs生成明显加速，并在血管壁沉积而难以降解，AGEs与RAGE结合后会使血管内皮细胞损伤及凋亡，最终导致血管动脉粥样硬化的形成^[7]。Palmieri等^[4]发现，p38MAPK信号通道可以调节TNFα的浓度而影响内皮细胞功能异常。Zeng等^[8]研究表明，西他列汀（一种DPP4抑制剂药物，可以通过抑制体内DPP4 酶提高体内GLP-1 的活性）部分通过p38MAPK信号通道达到抑制小鼠AS的进程。Lu等^[9]的结果表明p38MAPK信号通路参与Exendin-4（GLP-1类似物）对于H9c2 心肌细胞的保护作用。但有关GLP-1 与p38MAPK在人血管内皮细胞之间的关系研究，国内外尚未见明确报道。本研究发现GLP-1可以抑制由AGEs诱导的血管内皮细胞的凋亡，并下调由AGEs引起的p-p38MAPK 蛋白的表达。该结果提示p38MAPK信号蛋白可能参与了GLP-1 保护血管细胞的行为。为了明确p38MAPK在GLP-1保护内皮细胞的作用，我们加入其特异性拮抗剂SB203580，发现经过GLP-1或SB203580预处理后的HUVECs，其受到AGEs诱导的细胞凋亡显著性的下降（P＜0.05）。由此提示GLP-1 至少部分通过下调p38MAPK蛋白的表达来保护由AGEs诱导的HUVECs的凋亡。此外，GLP-1组较SB203580组在细胞凋亡有显著的差异，GLP-1在保护血管内皮细胞损伤除了p38MAPK信号通道之外可能还存在还有别的信号通路。相关研究表明^[10]，GLP-1可通过cAMP/PKA/Rho信号通道达到抑制高血糖导致的心微血管内皮细胞凋亡的作用，GLP-1 可通过下调VCAM-1 和ICAM-1 的表达而达到抑制AGEs对人视网膜色素上皮细胞的损伤^[11]。Aronis 等^[12]试验表明，GLP-1可通过AKt、PKC和src途径改善HUVECs的血管再生情况。柯甦捷等^[13]研究发现，Exendin-4（一种GLP-1类似物）可以通过抑制NF-κB通道减轻高糖联合TNF-α诱导的血管内皮损伤。可以推测，GLP-1保护内皮细胞的作用可能是多途径多通道的。He等^[14]发现，Exendin-4 抗炎作用部分是通过下调p38MAPK的表达。炎症与细胞凋亡及损失的关系十分密切，然而GLP-1的抗内皮细胞凋亡的机制是独立与其抗炎作用还是其抗炎作用的后续结果？国内外尚无相关研究，仍需要我们进一步研究。

一氧化氮合成酶是合成一氧化氮（NO）的关键酶，而eNOS 在血管内皮细胞的NO的释放有着非常重要的地位。在血管内皮细胞中NO具有松弛血管平滑肌、调节血管张力、细胞凋亡及抑制血小板聚集粘附等作用^[15]。Koska 等^[16]发现，Exendin-4（GLP-1类似物）可通过激活AMPK 使人小动脉内皮细胞eNOS水平提高，从而达到保护内皮细胞的作用。本课题的前期研究也证实，GLP-1 可以通过PKA 信号蛋白调高人脐静脉内皮细胞eNOS的活性，从而保护血管内皮细胞。

p38MAPK信号蛋白参与GLP-1 保护血管内皮细胞的作用是否涉及到eNOS活性的调节，国内外尚无明确报道。本研究检测各实验组的eNOS蛋白表达。发现AGEs组下调了磷酸化eNOS的表达，而GLP-1组及SB203580组都上调了磷酸化eNOS的活性，3组数据差异具有统计学意义。表明GLP-1 及SB203580 可以通过上调磷酸化eNOS的表达来达到保护内皮细胞的作用。p38MAPK蛋白可以通过上调eNOS的表达而抑制由AGEs诱导的内皮细胞凋亡的作用。

综上所述，GLP-1可通过抑制p38MAPK蛋白磷酸化，随后上调磷酸化eNOS蛋白的表达，对HUVECs起到抗凋亡的保护作用，为减轻糖尿病血管损伤，减缓血管粥样硬化的进程提供了新的思路。