类风湿关节炎（RA）是一种以关节慢性病变为主的自身免疫疾病，可最终导致关节畸变及功能丧失，其病变除关节外尚可累及其他组织、脏器^[1]。肺由于其富含结缔组织与血管，又有着密集联系的循环体系，因而成为RA较易累及的器官之一。RA肺部病变呈起病隐匿、病情进展快、病死率高的特点，严重危及患者生命而成为RA首要死因。RA累及至肺组织主要侵犯周边肺泡、肺泡间隔、邻近小气道和小血管，从而引起肺功能降低。RA肺病变早期呼吸系统症状及肺部X线片、CT表现不典型，而肺功能降低早于临床表现及胸部影像学异常。因此，针对RA肺部病变早期无症状或不典型，较易被忽视的特点，有必要对RA肺功能降低进行研究。RA肺病变引起肺功能降低的发病机制尚不明确，其机制可能与RA炎症反应、免疫损伤，涉及细胞、细胞因子、细胞外基质及信号传导通路等因素相互作用。前期研究表明RA发生、发展可能与Notch 信号传导通路有关^[2]。Notch通路传导失衡导致调控Treg不足，促使免疫调节功能紊乱，最终导致RA肺功能降低。因此，从Notch信号通路对Treg调节途径研究RA肺功能降低具有重要意义。治疗RA肺功能降低应用西药如糖皮质激素、免疫抑制剂等有一定的疗效，但长期应用副反应增多，患者多不能耐受或依存性差，远程疗效不理想。而中医药在治疗RA肺病变中优势明显。中药如雷公藤制剂应用于临床治疗RA及其肺病变疗效显著^[3-4]。雷公藤有效成分之一雷公藤甲素（TPT）具有抗炎及抑制细胞免疫和体液免疫等作用^[5]。TPT能显著抑制关节肿、抑制组织胺所致的毛细血管通透性增加及棉球肉芽增殖^[6]。同时，TPT具有抗肺间质纤维化作用，减少炎性介质对组织脏器的刺激。为了进一步探讨TPT对RA肺病变的作用机制,本文通过复制类风湿关节炎动物模型，观察该药对佐剂性关节炎大鼠肺功能及肺组织Notch受体/配体的影响，现将研究结果作简要阐述。

体质量160±20 g、鼠龄5~6月的清洁级雄性SD大鼠40只（南京医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK苏2010-0008）。清洁级标准饲养。

TPT 由南京康惟盛生物技术公司提供（纯度≥98%），CAS号38748-32-2；甲氨喋呤（MTX）：2.5 mg/片，由上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，国药准字H31020644，批号20090104；弗氏完全佐剂（FCA）：由美国SIGMA出品，批号：104k8527；Trizol总RNA提取液:上海英杰公司提供，批号：1382757；PCR试剂盒：美国DUPONT，批号：11DP0376；组织石蜡包埋机：LEICA，型号：A130395；石蜡切片机：德国LEICA，型号：RM2245；染色机：德国SLEE，型号：MAS；显微镜：日本OLYMPUS公司，型号：BX53。

40只大鼠随机均分为正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、TPT组、MTX组，除NC组外，其余大鼠右足跖皮内注射FCA 0.1 mL致炎，复制成佐剂关节炎（AA）大鼠模型^[7]。致炎后第12天开始给药，通过人体体表面积计算动物给药剂量。TPT组给药浓度为1 mg/100 g，1 次/d；MTX组：浓度为0.3 mg/100 g，1 次/周；NC组及MC组给予生理盐水浓度为1 mL/100 g，1次/d。各组连续用药30 d。

分别在造模前1 d、致炎后第12天、给药后测量各组大鼠后足跖的容积，计算各组大鼠E^[8]。E=（造模后足趾容积—造模前足趾容积）/造模前足趾容积。AI^[9]：致炎后第12天开始观察并记录全身病变。根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累积积分5级评分法评价。肢体或关节无红肿（0分），小趾关节红肿（1分），趾关节和足跖关节肿胀（2分），踝关节以下的足爪肿胀（3分），包括踝关节在内的全部足爪肿胀（4分）。肺功能测定^[10]：采用大鼠肺功能仪检测肺功能水平。肺功能测定参数包括用力肺活量（FVC）、25%肺活量的最大呼气流量（FEF₂₅）、50%肺活量的最大呼气流量（FEF₅₀）、75%肺活量的最大呼气流量（FEF₇₅）、最大呼气中期流量（MMF）、用力最大呼气流量（PEF）。

各组大鼠取后足远端趾间关节，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙5周；石蜡包埋，切片，HE染色。显微镜观察大鼠关节滑膜及软骨组织病理形态变化。

Notch受体、配体引物设计与合成由上海生工完成。肺组织总RNA提取、反转录及PCR参照试剂说明书完成。

采用SPSS 17.0处理，实验数据为连续性变量用均数±标准差表示，样本均采用正态性检验，计量资料采用t检验；等级计数资料转化为计量资料，检验水准为0.05。

给药前，除NC组外，其余大鼠均造模成功，给药前，MC组、MTX组、TPT组大鼠E、AI显著高于NC组（P＜0.05或P＜0.01）。给药后，与NC组比较，MC组大鼠E、AI显著升高（P＜0.01）；与MC组比较，MTX组、TPT组大鼠E、AI显著降低；与MTX组比较，TPT组大鼠E、AI显著降低（P＜0.05，图 1、2）。

图 1(Figure 1)

图 1 各组大鼠足趾肿胀度的变化 Figure 1 Changes of the paw edema volume in the rats.

图 2(Figure 2)

图 2 各组大鼠关节炎指数的变化 Figure 2 Changes of the arthritis index in the rats

MC组大鼠关节滑膜可见大量炎性细胞浸润；滑膜血管增多，血管壁及其周围附属组织可见大量炎细胞浸润；滑膜组织增生，呈绒毛状突起，部分滑膜组织嵌入关节腔内；滑膜衬细胞分层增多并增厚；部分关节软骨可见血管翳形成（图 3A）。NC组大鼠关节滑膜组织结构清晰，滑膜无肥大、突起，无炎细胞浸润；滑膜细胞分界清楚，分层较少；关节面平整无损伤，关节软骨、软骨下骨及周围肌腱结构完整（图 3B）；TPT组大鼠关节滑膜可见少量中性粒细胞等炎细胞浸润，部分滑膜组织嵌入关节腔内；关节面较规整（图 3C）；MTX组大鼠关节滑膜可见嗜中性粒细胞等炎细胞浸润，同时浸润其周围附属组织，滑膜血管增多，血管翳形成并增生，滑膜组织呈绒毛状突起并嵌入至关节腔内，滑膜衬细胞增厚（图 3D）。

图 3(Figure 3)

图 3 各组大鼠关节滑膜光镜下观察 Figure 3 HE staining of the synovial membrane in the rats (Original magnification: × 200). A: MC group; B: NC group; C: TPT group; D: MTX group

给药30 d 后，MC组大鼠肺功能参数FVC、FEF25、FEF50、FEF75、MMF、PEF显著降低。经TPT治疗后，TPT组FVC、FEF25、FEF50、FEF75、MMF、PEF升高（P＜0.05或P＜0.01，表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠肺功能的比较 Table 1 Comparison of pulmonary function between the groups (Mean±SD, n=10) Group Pulmonary function FVC (mL） FEF25 (mL/s) FEF50 (mL/s) FEF75 (mL/s) MMF (mL/s) PEF (mL/s) NC 9.21±1.03 45.42±5.83 39.14±2.13 37.33±3.65 39.24±3.72 39.15±5.85 MC 6.02±0.57b 30.75±1.63b 27.02±3.17b 37.17±2.89 39.26±4.72 39.28±2.89 MTX 6.43±0.65b 36.78±2.54 bc 30.34±4.92b 24.17±5.82b 31.76±4.36b 33.80±3.11b TPT 7.15±0.42 bce 42.28±3.68cd 40.29±4.34ce 34.49±4.85cd 37.31±3.62cd 37.37±2.35cd Note: Compared with NC group, aP＜00.05, bP＜00.01; Compared with MC group, cP＜0.01; Compared with MTX group, dP＜0.05, eP＜ 0.01.

表 1 各组大鼠肺功能的比较 Table 1 Comparison of pulmonary function between the groups (Mean±SD, n=10)

与NC 组相比，MC 组、MTX 组Notch3、Notch4、Delta1 表达升高，TPT 组Notch3、Delta1 升高（P＜0.05,P＜0.01）；MC 组、MTX 组、TPT 组Notch1、Jagged1、Jagged2降低（P＜0.05,P＜0.01）。与MC组相比，MTX组Jagged1升高，TPT组Notch1、Jagged1、Jagged2、Jagged1升高（P＜0.05,P＜0.01）；TPT 组Notch3、Notch4、Delta1降低（P＜0.05,P＜0.01）。与TPT组相比，MTX组Notch1、Jagged1降低（P＜0.05,P＜0.01，表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠肺组织Notch受体及配体的表达的比较 Table 2 Comparison of expressions of Notch receptors and ligands in the rats (Mean±SD, n=8) Group Expressions of Notch receptors and ligands（mRNA, IOD） Jagged1 Jagged2 Delta1 Notch1 Notch2 Notch3 Notch4 NC 0.67±0.09 0.58±0.09 0.46±0.05 0.68±0.12 0.58±0.09 0.47±0.06 0.42±0.04 MC 0.37±0.05a 0.36±0.05a 0.67±0.11a 0.50±0.06a 0.61±0.12 0.69±0.14a 0.54±0.09a MTX 045±0.06ace 0.43±0.08b 0.56±0.06bd 0.48±0.07ae 0.60±0.07 0.54±0.05a 0.52±0.07b TPT 0.53±0.04c 0.47±0.07d 0.53±0.08d 0.55±0.06d 0.57±0.04 0.52±0.06bd 0.45±0.06d Note: Compared with NC group, aP＜0.05, bP＜0.01; Compared with MC group, cP＜0.01, dP＜0.01; Compared with MTX group, eP＜0.05.

表 2 各组大鼠肺组织Notch受体及配体的表达的比较 Table 2 Comparison of expressions of Notch receptors and ligands in the rats (Mean±SD, n=8)

多元相关分析结果显示，肺功能参数FVC 与Notch3、Delta1呈反比（r=-0.584,P=0.034; r=-0.647,P=0.028），PEF 与Notch4 呈反比（r=-0.651,P=0.027）；FEF50 与Notch1 呈正比（r=0.682,P=0.023），FEF75 与Jagged1呈正比（r=0.595,P=0.031）。

Notch信号传导通路在各种免疫细胞中有广泛表达，可影响发育过程中多种细胞的分化、增殖和凋亡。通过Notch（1-4）受体及Jagged1-2/Delta1配体的相互作用产生旁侧抑制效应，控制细胞对各种内、外源信息的反应，从而导致细胞特异性分化，是一种影响胚胎发育、器官形成的普遍机制^[11-12]。

Notch信号途径可调控RA的免疫系统^[13-14]。Notch信号在RA外周免疫系统的分化和调节中起作用，在成熟的淋巴细胞和APCs的表面均有Notch受体及其配体的表达。同时，Notch信号途径可调控肺泡上皮细胞的分化，在肺的生长发育中起重要作用^[15]。研究表明^[16-17]，Notch1信号可能通过介导碱式螺旋-回旋-螺旋（bHLH）转录因子的表达，调控肺泡上皮和血管内皮细胞的增殖、分化、迁移等生物学活动。Notch1阳性反应主要定位在肺泡上皮细胞，支气管上皮细胞表达较少；Notch2均匀分布于上皮细胞、血管内皮及间质细胞；Notch3则在血管内皮细胞内呈强表达；Jagged1主要分布于成纤维细胞及肺泡腔、间质，在肺泡上皮细胞仅为弱阳性表达。在Notch 组中Notch1、Jagged1、Jagged2 升高，Notch3、Notch4、Delta1的表达降低，通过保护肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞免于炎症刺激，减少RA成纤维细胞增生和肺间质纤维化的发生。在本组研究中我们发现，AA大鼠E及AI明显升高，同时肺功能检测结果显示，FEF₂₅、FEF₅₀、FEF₇₅、MMF、PEF 明显降低，表明AA大鼠在关节炎症反应的基础上可进一步导致肺功能下降，其肺功能的变化主要是表现为小气道功能的严重损伤，并伴有限制性通气功能障碍。而AA大鼠肺功能降低的过程可能与Notch通路的参与有关。本次研究中相关分析显示肺功能参数FVC与Notch3、Delta1呈反比，PEF 与Notch4 呈反比；FEF50 与Notch1 呈正比，FEF75与Jagged1呈正比。说明AA中肺组织Notch1、Notch3、Notch4、Delta1、Jagged1-2的表达部位具有高度一致性，推测肺组织细胞可能同时携带Notch受体和配体，与相邻肺细胞之间互相传递信息。Notch1、Jagged1、Jagged2的表达较正常对照组显著下调，Notch3、Notch4、Delta1的表达显著上调，说明在AA大鼠在关节处于病变期时，Notch信号通过级联放大效应促进肺组织损害作用。

雷公藤生理活性是由二萜内酯、生物碱、三萜等多种成分协同产生^[18-19]，雷公藤制剂广泛应用于治疗RA疾病中，特别是类风湿关节炎合并肺间质病变，疗效显著。雷公藤甲素是雷公藤干燥去皮根经提取、纯化后得到的有效组分^[20]。本次研究我们发现，TPT治疗后AA大鼠肺功能参数FEF₂₅、FEF₅₀、FEF₇₅、MMF、PEF明显升高，提示TPT能显著改善AA大鼠肺功能的水平，提高肺功能。同时，与MC组相比，TPT 组E、AI 及Notch3、Notch4、Delta1的表达降低，Notch1、Jagged1、Jagged2及Treg的表达升高。并且在与MTX组比较，TPT组在调节Notch信号通路方面明显优于MTX组。说明TPT 改善AA大鼠关节局部症状的机制跟激活Notch 信号传导通路有关，可能是通过上调Notch1、Jagged1、Jagged2的表达，下调Notch3、Notch4、Delta1的表达。雷公藤具有免疫抑制作用,可抑制RA患者体内异常免疫反应。TPT通过抗炎、抗氧化等发挥免疫调节作用^[21]。雷公藤多甙能改善肺泡炎和纤维化，雷公藤制剂单体可减轻肺泡炎和肺纤维化程度。雷公藤毛单体可减轻肺纤维化模型大鼠肺组织病理学改变，降低肺泡炎和肺纤维化程度，具有一定的抗肺纤维化的疗效^[22-23]。使肺泡壁重新上皮化以恢复气血屏障的重要功能。本次研究结果显示，TPT作用于AA大鼠后，调节Notch信号通路中受体、配体表达，可能是通过抑制AECⅡ和血管内皮细胞的增殖、分化，使得肺泡上皮细胞分泌肺表面活性物质及转分化功能趋于正常，致使肺泡上皮细胞数量进一步增加，改善肺泡通气/换气功能障碍，从而提高肺功能参数FVC、FEF₂₅、FEF₅₀、MMF、PEF等，改善肺功能水平。

综上所述，TPT改善AA大鼠肺功能水平的机制可能是通过调节Notch信号传导通路受体、配体表达，从而改善关节局部症状和肺部损伤。