上呼吸道感染（上感）是儿童最普遍的感染性疾病，是5岁以下儿童病死的首位原因，严重影响小儿的身体健康及发育。甘露聚糖结合凝集素（mannan binding lectin, MBL）缺损是导致儿童反复上呼吸道感染感染的主要因素之一^[1-2]。MBL识别病原体后，以Ca²⁺依赖方式激活MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBL-associated serine proteaes, MASP1和MASP2）而进一步激活补体凝集素途径，发挥溶破和调理吞噬功能^[3]。MASP2主要由肝脏合成分泌，是激活凝集素途径的关键蛋白酶，而凝集素途径还可由几种胶原纤维素（ficolins）活化，故认为MASP2在凝集素途径中的作用更甚于MBL。研究表明，血清MASP2浓度与感染性疾病密切相关，MASP2水平降低使得白血病患者在接受化疗后更易感染，是易于导致白血病患者高频率发热的一个因素^[4]。目前，尚未见血浆MASP2浓度与上感关系的报道。故而设计本实验，意欲了解血浆MASP2水平与上感易感性的关系，然而却发现上感儿童血浆MASP2水平高于正常对照儿童，这一结果与预期相悖。因此，我们试图从MASP2水平与上感有关临床指标的关系等方面来探讨其可能意义。

选取2014年10月~12月在南方医院儿科门诊接受治疗的103例上感患儿作为研究对象，其中男53例，女55例，年龄0~13岁，平均年龄3.1岁。所有患者均符合第七版《儿科学》中的诊断标准^[5]，无其他慢性疾病。根据上感组CRP水平分为CRP升高组（CRP > 5 mg/L）和CRP正常组（CRP≤5 mg/L)；根据上感组WBC水平分为WBC升高组（WBC > 9.5×10⁹ G/L）和WBC正常组（≤9.5×10⁹ G/L， > 3.5×10⁹ G/L）；根据是否用药分为感染早期（出现症状后1~3 d内）未用药组及感染中后期已用药（主要是抗病毒药利韦巴林和抗细菌药头孢类抗生素）组。另选取对照组35例，为同期健康体检的正常儿童，年龄0~13岁，平均年龄4.7岁。

主要仪器：多功能标记分析仪（PerkinElmergo，美国）、恒温水浴锅（金坛市医疗仪器产，中国江苏）、离心机（Eppendorf，德国）、Cobas 501全自动生化分析仪（Roche，德国）、HST302血细胞分析流水线XE-2100血液分析仪（Sysmex，日本）。主要试剂：MASP2检测试剂盒（USCN，中国武汉）、CRP检测试剂盒（Roche，德国）。

取静脉血1 mL，抗凝；静置10 min，3000 r/min离心10 min，留取上清液；置-70 ℃冰箱保存，供测定MASP2浓度用。

CRP严格按照试剂盒说明书操作，采用颗粒增强透射免疫比浊法测定。WBC采用流式细胞计数法测定。

按试剂盒说明书操作，简述如下：吸取稀释血浆（1:100）和8个不同浓度的标准品液各100 μL，加于各对应孔中，37 ℃水浴2 h；弃去液体并甩干后，每孔加入生物素化的MASP2抗体溶液100 μL，37 ℃水浴1 h；洗涤液洗涤，1.5 min×3次；每孔加入HRP标记的亲和素溶液100 μL，37 ℃水浴0.5 h，洗涤5次；每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15 min后，每孔加入终止液50 μL终止反应。在多功能标记分析仪上测定各孔A_{450 nm}值，根据标准曲线得到各样本MASP2浓度值。

所有数据应用EXCEL建立数据库，采用SPSS16.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料组间比较以非方差齐性两样本独立t检验及Spearman相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

应用生物信息学分析MASP2基因与急性期蛋白MBL、CRP基因是否存在共同的应激元件。DNA序列比对网站为NCBI/ BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）UCSC（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway），microRNA数据库网站是CHIPBase（http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/），转录因子结合谱数据库为JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）。

103例上感患者血浆样本与35例健康儿童血浆样本经ELISA试剂盒检测，得到MASP2浓度值。上感组与对照组血浆MASP2水平有非常显著差异（t=11.126，P < 0.001）。上感组血浆MASP2浓度区间为[159, 640]，平均浓度为316 ng/mL；健康对照组浓度区间为[33, 304]，平均浓度130 ng/mL（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 上感组和对照组血浆MASP2浓度比较 Figure 1 Comparison of plasma MASP2 concentrations between URTI group and normal control group, ***P < 0.001.

对103例上感患者血浆MASP2浓度与年龄做Spearman相关分析，得出上感组血浆MASP2浓度与年龄成显著正相关（r=0.302，P < 0.01）。将103例患者按照性别分为男、女2组，进行两样本的独立t检验，发现男性组血浆MASP2略高于女性组，但2组之间血浆MASP2水平无统计学差异（P > 0.05，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 上感儿童血浆MASP2水平与年龄和性别的关系 Figure 2 Relations of plasma MASP2 levels with age (A) and gender (B) in URTI group.

上感儿童CRP正常组与CRP升高组血浆MASP2浓度均升高且均值无明显差异（P > 0.05）。然而，将血浆MASP2浓度与CRP值进行Spearman相关分析，却发现CRP升高组MASP2浓度与CRP值呈正相关（r=0.310，P < 0.05），但CRP正常组MASP2浓度与CRP值无明显相关性（r=0.055，P > 0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 上感儿童血浆MASP2水平与CRP值的关系 Figure 3 Relations of plasma MASP2 level with CRP level in children with URTI. A: Comparison of plasma MASP2 levels between the elevated CRP group and the normal CRP group; B: Correlation analysis between plasma MASP2 level and CRP in the elevated CRP group; C: Correlation analysis between plasma MASP2 level and CRP in the normal CRP group.

上感儿童WBC正常组与WBC升高组血浆MASP2浓度均升高且均值无差别（P > 0.05）。然而，分别将血浆MASP2浓度与WBC值进行Spearman相关分析却发现，WBC升高组MASP2浓度与WBC值呈正相关（r=0.392，P < 0.01），但WBC正常组MASP2浓度与WBC值无明显相关性（r=0.075，P > 0.05，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 上感儿童血浆MASP2水平与WBC值的关系 Figure 4 Relations between plasma MASP2 level and WBC in children with URTI. A: Comparison of plasma MASP2 levels between the elevated WBC group and the normal WBC group; B: Correlation analysis between plasma MASP2 level and WBC in the elevated WBC group; C: Correlation analysis between plasma MASP2 level and WBC in the normal WBC group.

感染早期未用药组儿童血浆MASP2平均浓度为336 ng/mL，感染中后期已用药组儿童为277 ng/mL，两者比较有显著差异（t=2.791，P < 0.01，图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 感染早期未用药组与感染中后期用药组血浆MASP2水平比较 Figure 5 Comparison of plasma MASP2 levels between early stage of infection without treatment group and mid-late stage of infection with treatment group. **P < 0.01.

应用生物信息学分析MASP2、MBL、CRP基因，结果表明它们具有共同的转录因子HNF-4α结合位点，不同基因中HNF-4α结合位点详见表 1。查询转录因子结合谱数据库，获得该转录因子结合的motif图谱（图 6）。HNF-4α结合于MASP2基因5'上游序列的结合位点，可调控MASP2基因的表达，提示MASP2也可能是一种急性期蛋白。

表 1(Table 1)

表 1 不同基因中转录因子HNF-4结合位点信息 Table 1 Information of transcription factor HNF-4α binding loci in different genes Binding region name Loci TF information MASP2 HNF4A_177 chr1:11107186-11107623 GSE22078HNF4A MBL2 HNF4A_3336 chr10:54527955-54528366 GSE22078HNF4A CRP HNF4A_1840 chr1:159675397-159675805 GSE22078HNF4A

表 1 不同基因中转录因子HNF-4结合位点信息 Table 1 Information of transcription factor HNF-4α binding loci in different genes

图 6(Figure 6)

图 6 转录因子HNF-4α调控MASP2基因表达示意图 Figure 6 Schematic diagram of MASP2 gene regulation by the transcription factor HNF-4α.

在发展中国家，急性呼吸道感染是儿童发病率最高的疾病，占门诊病人20%~40%。上感是鼻炎、咽炎、扁桃体炎、中耳炎等急性炎症的总称，占呼吸道感染疾病的87.5%^[5]。不少报道描述了血清MASP2浓度与麻风病^[6]、美洲锥虫病^[7]、风湿性关节炎^[8]等疾病之间的关系。有报道MASP2水平偏高者更易感染丙型肝炎病毒^[9]，但亦有研究发现MASP2水平低下的患者在原位肝移植术后更容易感染细菌^[10]。目前，尚未见研究血浆MASP2水平与上感关系的报道。

本研究发现，上感儿童血浆MASP2浓度区间为159~640 ng/mL，平均浓度为316 ng/mL，而对照儿童血浆MASP2浓度区间为33~304 ng/mL，平均浓度为130 ng/mL，上感儿童血浆MASP2浓度显著高于对照儿童（P < 0.001）。推测其原因可能是，患儿在受到病毒和/或细菌的侵袭时，刺激MASP2合成显著增加，从而激活补体凝集素途径并发挥调理吞噬作用。上感组儿童血浆MASP2水平与年龄显著相关（P < 0.01），但男、女2组血浆MASP2浓度无统计学差异，表明MASP2水平的变化与年龄长幼有很大关系，也提示儿童时期MASP2合成分泌的发育不完全，是机体免疫功能低下的一个方面。上感儿童CRP正常组与CRP升高组血浆MASP2浓度均升高且均值无差别，但CRP升高组血浆MASP2水平与CRP值呈正相关（P < 0.05），而CRP正常组血浆MASP2浓度与CRP值无相关性。CRP是在肝脏合成的一种急性期蛋白，是炎症及感染疾病的一个早期指标。正常情况下CRP浓度小于5 mg/L，但在应激条件下如感染、炎症、组织损伤等，血浆CRP浓度可快速升高，最高达500倍，且其升高程度与感染或炎症的严重程度呈正相关^[11]。上感儿童WBC正常组与WBC升高组血浆MASP2浓度均升高且均值无差别，但WBC升高组MASP2水平与WBC值显著正相关（P < 0.01），而WBC正常组MASP2水平与WBC值无显著相关性。白细胞是机体防御系统的重要组成部分，当病原体侵入体内时，机体就会动员白细胞，释放入外周循环。如果外周白细胞数量高于正常值，很可能是机体被感染或有其它炎症。因此，血浆MASP2水平升高也可从另一个角度表明患者感染或炎症的严重程度。我们还发现，感染早期未用药上感儿童血浆MASP2浓度显著高于感染中后期已用者（P < 0.01）。感染后，机体免疫系统被激活，释放大量IL-6、TNF-α等细胞因子，可能刺激MASP2分泌，而使用抗病毒药物及抗生素等后，随着病原体被杀灭和炎症缓解，对MASP2合成分泌的刺激作用减弱，此时MASP2水平也就降低了。小儿上感80%为病毒感染，在病毒感染早期CRP值一般小于1 mg/L，未治疗或治疗无效时可能会继发细菌感染，此时CRP值会显著升高。所以约52.9%的患儿CRP值并未出现异常。临床上常联合CRP值与WBC值作为辅助诊断细菌性上感的参考依据^[12]。本研究发现，有些患儿MASP2浓度很高如大于600 ng/mL，但CRP值正常，而WBC值却显著升高；另一方面，MASP2浓度高于600 ng/mL的个别患儿，CRP值高于200 mg/L，但WBC计数确正常。WBC值是判断患者有无细菌感染的传统指标，但其受患者年龄、日间变化、应激、药物治疗等因素影响，也与个体差异相关，有的患儿免疫功能低下，机体反应低下，所以WBC值的敏感性有一定局限性。因此在诊断细菌感染时仅作为一个参考指标。病毒感染时，患儿早期WBC值正常或者偏低，而此时病毒感染可能通过促炎细胞因子的介导，刺激MASP2大量分泌。上述资料表明，在上感儿童，不论CRP、WBC值是否正常，MASP2值均升高，提示后者比前二者更全面且敏感。因此，联合应用MASP2、CRP、WBC指标对于辅助诊断上感（尤病毒性）可能是有价值的。

鉴于上述发现，我们假设MASP2为类似CRP和MBL的急性期蛋白。机体受到应激原（如感染、炎症、组织损伤、烧伤、局部缺血坏死以及恶性肿瘤）刺激后短时间内即可出现血清成分的变化，称为急性期反应（acute-phase response, APR)，参与急性期反应的物质一般为蛋白质，所以称急性期蛋白。肝脏中APR是由IL-6、IL-1、TNF-α等细胞因子作用于HNF（hepatic nuclear factors）家族转录因子^[13]，转录因子激活后，识别相应基因的启动子区域，从基因水平调控APR反应。通过UCSC genome Browser搜索发现，CRP、MBL2和MASP2基因均含1个HNF-4α结合位点。通过DeepBase点chip发现，在CRP的1840位置（http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/viewChipSeqInfo.php?table=GSE22078HNF4A&database=hg19&id=1840）、MBL的3336位置（http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/viewChipSeqInfo.php?table=GSE22078HNF4A&database=hg19&id=3336）和MASP2的177位置（http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbas/viewChipSeqInfo.php?table=GSE22078HNF4A&database=hg19&id=177）各有1个HNF-4α结合位点。CRP和MBL都是典型的急性期蛋白，而HNF-4α是肝脏应激反应中重要且特异的转录因子^[13]。资料表明，CRP、MBL、MASP2基因具有共同的应激元件且均被HNF-4α识别，MASP2可能是急性期蛋白。

综上，我们推论MSAP2为急性期蛋白，血浆MASP2水平可能作为辅助诊断小儿上感的一个参考指标，也可用于辅助诊断其它有关疾病。至于其是否比CRP、WBC指标更具优势，则需更多的研究加以明确。