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  南方医科大学学报  2015, Vol. 35Issue (5): 728-732  DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2015.05.21.
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王巍, 孟灿, 刘佳, 杨志刚. 急性髓系白血病CDX2和β-catenin基因表达的相关性[J]. 南方医科大学学报, 2015, 35(5): 728-732. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2015.05.21.
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WANG Wei, MENG Can, LIU Jia, YANG Zhigang. Expressions of CDX2 and β-catenin and their correlation in acute myeloid leukemia[J]. Journal of Southern Medical University, 2015, 35(5): 728-732. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2015.05.21.
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基金项目

广东省自然科学基金（S2012040006822）；广东省医学科研基金（A2012419）；东莞市高等院校、科研机构科技计划项目（2012108102041）；广东医学院博士启动基金（XB1017）；湛江市科技攻关项目（2010C3104010）

作者简介

王巍，副教授，E-mail: 532723336@qq.com;
孟灿，硕士，E-mail: 564680017@qq.com。

通信作者

杨志刚，教授，博士生导师，E-mail: yangzhigangcn@aliyun.com

文章历史

收稿日期：2014-12-05
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
急性髓系白血病CDX2和β-catenin基因表达的相关性
王巍1,2, 孟灿1,2, 刘佳1,2, 杨志刚1,2     
1. 广东医学院 血液病研究室，广东 湛江 524000 ;
2. 广东医学院 附属医院血液内科，广东 湛江 524000
收稿日期：2014-12-05
基金项目：广东省自然科学基金（S2012040006822）；广东省医学科研基金（A2012419）；东莞市高等院校、科研机构科技计划项目（2012108102041）；广东医学院博士启动基金（XB1017）；湛江市科技攻关项目（2010C3104010）
作者简介：王巍，副教授，E-mail: 532723336@qq.com;
孟灿，硕士，E-mail: 564680017@qq.com。
通信作者：杨志刚，教授，博士生导师，E-mail: yangzhigangcn@aliyun.com
摘要: 目的 研究急性髓系白血病（AML）患者CDX2与β-catenin基因表达的相关性。 方法 实时定量PCR方法检测92例初诊AML、30例非恶性血液病患者（对照）CDX2及β-catenin mRNA表达，Western blot检测其中的26例AML、8例非恶性血液病患者CDX2、β-catenin蛋白表达。 结果 AML组CDX2 mRNA和蛋白表达阳性率分别为84.78%和76.92%，对照组未检测到表达（P < 0.01）；β-catenin mRNA和蛋白在两组均表达，但AML组显著高于对照组（P < 0.01）。CDX2、β-catenin mRNA表达均与初诊时白细胞数、LDH水平呈正相关（P < 0.01）。AML患者获得完全缓解时，CDX2 mRNA转阴、β-catenin mRNA表达显著下降，复发时两者均增高。AML患者CDX2与β-catenin无论在mRNA和蛋白水平表达均呈显著正相关（P < 0.01）。 结论 AML患者存在CDX2基因过表达及Wnt/β-catenin信号通路激活，且CDX2与β-catenin表达呈显著正相关。
关键词: 急性髓系白血病    CDX2    β-catenin    基因表达    
Expressions of CDX2 and β-catenin and their correlation in acute myeloid leukemia
WANG Wei1,2, MENG Can1,2, LIU Jia1,2, YANG Zhigang1,2     
1. Laboratory of Hematology, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, China ;
2. Department of Hematology, Affiliated Hospital, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, China
Abstract: Objective To investigate the expressions of CDX2 and β-catenin and their correlation in acute myeloid leukemia (AML). Methods Real-time PCR was used to examine the expressions of CDX2 and β-catenin mRNA in 92 de novo AML and 30 non-malignant patients (control), and Western blot was employed to detect CDX2 and β-catenin protein expressions in 26 de novo AML and 8 non-malignant patients. Results The positivity rates of CDX2 mRNA and protein expressions in AML group were 84.78% and 76.92%, respectively, but no CDX2 mRNA or protein expression were detected in control group (P < 0.01). The expressions of β-catenin mRNA and protein were detected in all the patients in both groups but its expressions in AML group were significantly higher (P < 0.01). The expressions of CDX2 and β-catenin mRNA were significantly correlated with WBC counts and LDH levels (P < 0.01). The expression of CDX2 mRNA was not detected and the expression of β-catenin mRNA was decreased to normal level in AML patients with complete remission, while the expressions of CDX2 and β-catenin mRNA were increased again in those with disease relapse. There were significantly positive correlations between CDX2 and β-catenin expressions at both mRNA and protein levels (P < 0.01). Conclusion Up-regulation of CDX2 gene and activation of Wnt/β-catenin pathway co-exist in AML patients and the expressions of CDX2 and β-catenin are positively correlated.
Key words: acute myeloid leukemia    CDX2    β-catenin    gene expression    

CDX2基因（cadual type homeobox gene-2，尾型同源盒-2）属于同源盒基因（HOX）家族中的一员，是发育相关基因，其表达失调与结直肠癌、急性白血病发病关系密切[1-4]，在急性白血病中CDX2的主要作用是促进细胞增殖、增强克隆形成能力[4-5]。Wnt/β-catenin信号通路是一条在进化中较为保守的通路，参与胚胎发育调节，其异常激活与多种肿瘤发病相关，如结直肠癌、白血病等[6-7]，该信号通路在急性白血病中也具有促进细胞增殖的作用[8-9]。CDX2基因和Wnt/β-catenin信号通路在急性白血病中的功能有相似之处，两者是否有协同作用？β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键分子，其表达增高可反映该通路的激活，为研究急性髓系白血病（AML）CDX2表达上调与Wnt/β-catenin信号通路激活的相关性，本文对CDX2和β-catenin基因从表达水平、临床意义、与疗效关系及不同病程表达变化几个方面进行了分析。

1 材料与方法 1.1 病例资料

收集我科2011年12月~2013年12月期间诊治的初发AML患者骨髓标本92例，诊断符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》。其中男性54例、女性38例，中位年龄48岁（9~87岁）。按照FAB分型：M1型1例、M2型20例、M3型9例、M4型25例、M5型22例、M6型3例、AML未定型12例。诱导治疗非M3患者采用标准剂量DA（柔红霉素+阿糖胞苷）、DAE（柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷）、CAG（吡柔比星+阿糖胞苷）、IA（去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷）方案；M3患者予以全反式维甲酸联合DA方案化疗。对照组30例为同期诊治的非恶性血液病患者（增生性贫血21例，特发性血小板减少性紫癜9例），其中男性16例、女性14例，中位年龄42岁（15~82岁）。

1.2 主要试剂和仪器

TRIzol、逆转录试剂盒、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒均购自TaKaRa公司，兔抗人CDX2抗体购自美国Abcam公司（ab76541）、兔抗人β-catenin抗体购自美国Proteintech公司（#51067-2-AP）、兔抗人GAPDH抗体购自Proteintech公司（#10494-1-AP），BCA蛋白定量及ECL发光试剂盒购自碧云天公司，化学发光成像系统为美国Proteinsimple公司。

1.3 方法 1.3.1 骨髓单个核细胞分离

取抗凝骨髓液2~5 ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加TRIzol或蛋白裂解液提取RNA或蛋白。

1.3.2 实时定量PCR

1×107细胞加1 ml TRIzol吹打混匀提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA质量和浓度，按照逆转录酶试剂盒说明书中的步骤逆转录cDNA。PCR引物设计好后由广州Invitrogen公司合成，CDX2上游：5'-TTCACTACAGTCGCTACATCA CC-3'，下游：5'-GCTGCAACTTCTTCTTGTTGATT-3'，扩增片段141 bp；β-catenin上游：5'-TGCAGTTCGCC TTCACTATG-3'，下游：5'-ACAGTCGTGGAATGGCA CC-3'，扩增片段162 bp；内参基因GAPDH上游：5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'，下游：5'-TGA GCTTGACAAAGTGGTCG-3'，扩增片段212 bp；。按SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行PCR反应，总体系10 μl，其中SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ（2×）5 μl，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μl，cDNA 1 μl，灭菌蒸馏水3.2 μl。PCR扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45个循环。计算2-ΔCT值作为各标本mRNA相对表达量，-ΔCT=（目的基因CT值-内参基因CT值）。

1.3.3 Western blot

取1×107细胞，PBS洗涤后悬浮于RIPA裂解液冰上裂解30 min，10 000 r/min离心10 min后取上清，BCA法测定蛋白浓度。取50~70 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜。5%脱脂奶封闭90 min，加入抗CDX2（1:500稀释）、β-catenin（1:1000稀释）、GAPDH（1:1000稀释）一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后室温孵育二抗2 h，TBST再次洗涤后ECL法显色。蛋白相对表达量=灰度值（母的蛋白）/灰度值（内参蛋白）。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。样本不符合正态分布，组间比较用Mann-Whitney U检验，AML各亚型整体比较用Kruskal-Wallis H检验，相关性分析用Spearman相关，高表达与低表达组间完全缓解率比较用χ2检验，初诊与治疗后的比较用配对的非参数分析。P < 0.05认为有统计学差异。

2 结果 2.1 RNA质量及方法可靠性分析

所提RNA经分光光度计检测，A260nm/A280nm值均在1.8~2.0之间，纯度好，可用于定量PCR检测。熔解曲线分析显示，各基因PCR扩增产物熔解温度均一，熔解峰为锐利的单一峰，说明扩增产物均一，无非特异扩增及引物二聚体。

2.2 CDX2、β-catenin基因在AML中的表达

定量PCR法检测92例初发AML和30例非恶性血液病患者（对照）CDX2和β-catenin表达，CDX2 mRNA在AML组的阳性率为84.78%，对照组无1例者表达（Z=-7.125，P=0.000）。β-catenin mRNA在两组均有表达，但AML组显著高于对照组（Z=-6.222，P=0.001）。CDX2和β-catenin mRNA表达水平在AML各亚型间（除外M1）均无统计学差异（P < 0.05，表 1）。收集到初发AML患者蛋白标本26例，非恶性血液病患者8例。Western blot检测显示，AML组有20例标本可检测到CDX2蛋白表达，阳性率为76.92%，对照组未检测到CDX2蛋白表达（Z=-4.103，P=0.001）。β-catenin蛋白在两组均有表达，AML组显著于对照组（Z=-3.662，P=0.001，表 2、图 1）。β-catenin、CDX2在蛋白水平的表达趋势基本与mRNA水平一致。

表 1 CDX2和β-catenin mRNA在AML组和对照组中的表达 Table 1 Expressions of CDX2 and β-catenin mRNA in AML and control groups
表 2 CDX2和β-catenin蛋白在AML组和对照组中的表达 Table 2 Expressions of CDX2 and β-catenin protein in AML and control groups
图 1 Western blotting检测AML组与对照组CDX2、β-catenin蛋白表达 Figure 1 Expressions of CDX2 and β-catenin protein in AML (P) and control (C) groups detected by Western blotting.
2.3 CDX2、β-catenin mRNA表达与AML患者临床特征的关系

CDX2 mRNA表达与AML临床特征的关系基本与β-catenin一致，两者均与AML患者性别、年龄、骨髓幼稚细胞比例无显著性相关，与初诊时白细胞数、LDH水平呈显著正相关（表 3）。这说明CDX2、β-catenin mRNA表达水平能反映白血病肿瘤负荷情况，肿瘤负荷越高，CDX2、β-catenin mRNA表达水平越高。

表 3 CDX2、β-catenin mRNA表达与AML临床特征的关系 Table 3 Correlations of CDX2 and β-catenin mRNA expressions with clinical characteristics in AML patients
2.4 CDX2和β-catenin mRNA表达与AML患者疗效的关系及病程中动态观察

可评估疗效的AML患者54例，CDX2 mRNA表达阳性45例，阴性9例。45例阳性表达患者中首疗程完全缓解（complete remission, CR）31例，CR率为68.89%；9例阴性表达患者首疗程CR 7例，CR率为77.78%，两组比较差异无统计学意义（χ2=0.284，P=0.594）。

配对分析同一AML患者初诊时和首疗程治疗后CDX2和β-catenin mRNA表达变化，共收集到符合标准的AML患者39例，首疗程达CR 23例，未达CR 16例（PR 7例、NR 9例）。患者获CR时CDX2 mRNA下降至检测不到，β-catenin mRNA表达下降至与对照组水平无显著差异（Z=-1.828，P=0.068），而未获CR患者CDX2和β-catenin mRNA表达水平介于初诊和CR时之间（表 4）。

表 4 初诊、首疗程治疗后及对照组CDX2、β-catenin mRNA表达水平比较 Table 4 Comparison of CDX2 and β-catenin mRNA expressions among new diagnosis, after first chemotherapy and control groups

跟踪5例首疗程未达CR患者（初诊时CDX2均阳性），第二疗程均达CR，此时CDX2 mRNA表达转阴，β-catenin mRNA表达下降至与对照组水平接近。收集到复发标本2例，这2例患者初诊时CDX2均阳性，CR时CDX2 mRNA表达转阴，β-catenin mRNA表达显著下降，分别于诊断7、10个月后复发，复发时CDX2 mRNA由阴转阳，β-catenin mRNA表达显著升高。

2.5 AML中CDX2与β-catenin表达的相关性分析

Spearman相关分析显示，无论在mRNA水平还是蛋白水平，CDX2与β-catenin表达均呈显著正相关（r=0.793，P=0.001；r=0.804，P=0.001）。

3 讨论

CDX2基因属于尾型同源框基因家族中的一员，是一种转录因子，参与胚胎发育、造血调控等。CDX2最初在胚胎的3个胚层均广泛表达，以后逐渐集中在内胚层表达，从新生儿早期开始至整个成年期基本只表达于小肠和结肠，调控肠道组织发育[10]。CDX2基因表达下调与肠道肿瘤密切相关[1-2]，被认为是肠道肿瘤的抑癌基因[11]。近年来的研究发现，急性白血病患者可检测到CDX2的异常表达，CDX2具有促进细胞增殖和克隆形成的作用，并可直接诱发小鼠AML[4-5]。由此可见，CDX2基因在不同细胞背景下功能不同[12-13]，其在肠道肿瘤发病中起的是抑癌基因作用，而在AML发病中起的是原癌基因作用。Wnt/β-catenin通路是体内重要的信号转导通路，其异常激活与白血病发病相关。

为研究CDX2表达上调与Wnt/β-catenin信号通路异常激活的相关性，本文分析了AML患者CDX2和β-catenin基因的表达、临床意义、与疗效的关系，并观察了两基因在AML不同病程的表达变化。结果显示，84.78%的AML患者表达CDX2 mRNA，而非恶性血液病对照无1例表达，与黎国伟等[14]报道的基本一致；同时AML患者有β-catenin的过度表达，且CDX2与β-catenin无论在mRNA还是蛋白表达水平均呈显著正相关。在临床意义方面，CDX2与β-catenin基本相同，两者均与反映肿瘤负荷的指标如初诊时白细胞数、LDH水平呈正相关，而与性别、年龄、骨髓幼稚细胞比例无显著性相关。在基因表达与AML疗效方面，CDX2基因表达阳性与否对首疗程CR率无显著影响。CDX2与β-catenin表达的动态变化均可反映疾病进程，当患者获得CR时，CDX2表达转阴、β-catenin下降至正常水平，复发时CDX2、β-catenin表达再次增高。CDX2与β-catenin基因在AML中的临床意义、不同病程表达变化基本一致，这也从另一个方面反映了CDX2与β-catenin之间存在相关性。两者之间究竟是怎样一种联系呢？查阅文献发现，在爪蟾胚胎和结肠腺癌细胞，Wnt/β-catenin信号通路调控CDX2表达[15-16]，AML细胞中CDX2基因表达上调是否是由Wnt/β-catenin异常激活引起的是我们下一步要研究的重点。

另外，绝大部分AML患者表达CDX2基因，且CDX2表达在各亚型间无显著差异，提示CDX2基因有可能成为广谱的白血病标志物。正常人和非恶性血液病患者不表达CDX2基因，CDX2基因仅在白血病细胞表达，且其表达水平与肿瘤负荷密切相关，并随疾病病程呈动态变化，提示CDX2基因有可能成为监测白血病微小残留的指标之一，但尚需扩大标本量、定期检测CDX2表达（如每隔3个月）、延长跟踪时间进一步观察。

参考文献
[1] Werling RW, Yaziji H, Bacchi CE, et al. CDX2, a highly sensitive and specific marker of adenocarcinomas of intestinal origin: an immunohistochemical survey of 476 primary and metastatic carcinomas[J]. Am J Surg Pathol,2003, 27 (3) : 303-10. DOI: 10.1097/00000478-200303000-00003.
[2] Hinoi T, Tani M, Lucas PC, et al. Loss of CDX2 expression and microsatellite instability are prominent features of large cell minimally differentiated carcinomas of the colon[J]. Am J Pathol,2001, 159 (6) : 2239-48. DOI: 10.1016/S0002-9440(10)63074-X.
[3] Thoene S, Rawat VP, Heilmeier B, et al. The homeobox gene CDX2 is aberrantly expressed and associated with an inferior prognosis in patients with acute lymphoblastic leukemia[J]. Leukemia,2009, 23 (4) : 649-55. DOI: 10.1038/leu.2008.355.
[4] Scholl C, Bansal D, Döhner K, et al. The homeobox gene CDX2 is aberrantly expressed in most cases of acute myeloid leukemia and promotes leukemogenesis[J]. J Clin Invest,2007, 117 (4) : 1037-48. DOI: 10.1172/JCI30182.
[5] Rawat VP, Thoene S, Naidu VM, et al. Overexpression of CDX2 perturbs HOX gene expression in murine progenitors depending on its N-terminal domain and is closely correlated with deregulated HOX gene expression in human acute myeloid leukemia[J]. Blood,2008, 111 (1) : 309-19. DOI: 10.1182/blood-2007-04-085407.
[6] Smith K, Bui TD, Poulsom R, et al. Up-regulation of macrophage wnt gene expression in adenoma-carcinoma progression of human colorectal cancer[J]. Br J Cancer,1999, 81 (3) : 496-502. DOI: 10.1038/sj.bjc.6690721.
[7] Simon M, Grandage VL, Linch DC, et al. Constitutive activation of the Wnt/beta-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia[J]. Oncogene,2005, 24 (14) : 2410-20. DOI: 10.1038/sj.onc.1208431.
[8] Chung EJ, Hwang SG, Nguyen P, et al. Regulation of leukemic cell adhesion, proliferation, and survival by beta-catenin[J]. Blood,2002, 100 (3) : 982-90. DOI: 10.1182/blood.V100.3.982.
[9] Ysebaert L, Chicanne G, Demur C, et al. Expression of beta-catenin by acute myeloid leukemia cells predicts enhanced clonogenic capacities and poor prognosis[J]. Leukemia,2006, 20 (7) : 1211-6. DOI: 10.1038/sj.leu.2404239.
[10] James R, Erler T, Kazenwadel J. Structure of the murine homeobox gene cdx-2. Expression in embryonic and adult intestinal epithelium[J]. J Biol Chem,1994, 269 (21) : 15229-37.
[11] Bonhomme C, Duluc I, Martin E, et al. The Cdx2 homeobox gene has a tumour suppressor function in the distal colon in addition to a homeotic role during gut development[J]. Gut,2003, 52 (10) : 1465-71. DOI: 10.1136/gut.52.10.1465.
[12] Renouf B, Soret C, Saandi T, et al. Cdx2 homeoprotein inhibits non-homologous end joining in colon cancer but not in leukemia cells[J]. Nucleic Acids Res,2012, 40 (8) : 3456-69. DOI: 10.1093/nar/gkr1242.
[13] Faber K, Bullinger L, Ragu C, et al. CDX2-driven leukemogenesis involves KLF4 repression and deregulated PPARγ signaling[J]. J Clin Invest,2013, 123 (1) : 299-314. DOI: 10.1172/JCI64745.
[14] 黎国伟, 王东宁, 叶玉蝶, 等. 急性髓细胞白血病CDX2基因表达及临床意义的探讨[J]. 中华肿瘤防治杂志,2009, 16 (16) : 1253-5.
[15] Keenan ID, Sharrard RM, Isaacs HV. FGF signal transduction and the regulation of Cdx gene expression[J]. Dev Biol,2006, 299 (2) : 478-88. DOI: 10.1016/j.ydbio.2006.08.040.
[16] Blache P, Van De Wetering M, Duluc I, et al. SOX9 is an intestine crypt transcription factor, is regulated by the Wnt pathway, and represses the CDX2 and MUC2 genes[J]. J Cell Biol,2004, 166 (1) : 37-47. DOI: 10.1083/jcb.200311021.