摘要:
目的 利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW 264.7,为研究gasdermin D(GSDMD)在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法 针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA),构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定,将Cas9质粒和pGL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW 264.7;qPCR检测cas9的表达;嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Western blot和测序鉴定。将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW 264.7细胞共培养,Annexin Ⅴ/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放水平分析细胞死亡情况。结果 qPCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW 264.7-Cas9细胞(P<0.01);PCR 及测序证明 pGL3-sgRNA 串联载体构建成功;PCR、测序及 Western blot 结果表明成功构建 gsdmd-/- RAW 264.7 细胞。Annexin Ⅴ/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率(P<0.01)。结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞,为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础。
周丽婷, 叶 颖, 原海波, 吴超逸, 吴淑燕. gsdmd基因敲除巨噬细胞RAW 264.7的构建:基于CRISPR/Cas9 系统[J]. 南方医科大学学报, 2021, 41(1): 116-122.