南方医科大学学报 ›› 2020, Vol. 40 ›› Issue (12): 1726-1731.doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2020.12.05
巩奇明,姜 艳,卢俊玲,尤燕舞
摘要: 目的 研究Fractalkine(CX3CL1,FKN)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞免疫应答的作用机制。方法 体外培养RAW264.7细胞,使用慢病毒技术构建过表达FKN的稳定细胞珠。细胞分为8组:(1)空白对照组;(2)LPS组,细胞给予脂多糖(1 μg/mL,12 h);(3)ICG-001组,细胞给与Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001(10 μmol/mL,48 h);(4)过表达FKN组;(5)ICG-001+LPS组,细胞给与ICG-001(10 μmol/mL预处理36 h)后,加入脂多糖(1 μg/mL,12 h);(6)过表达FKN+LPS组,过表达
FKN细胞给与脂多糖(1 μg/mL,12 h);(7)过表达FKN+ICG-001组,过表达FKN细胞给予ICG-001(10 μmol/mL,48 h);(8)过表达 FKN+ICG-001+LPS 组,过表达 FKN 细胞给与 ICG-001(10 μmol/mL 预处理 36 h)后,加入脂多糖(1 μg/mL,12 h);应用
CCK-8细胞增殖实验检测ICG-001作用于巨噬细胞中的安全浓度;应用酶联免疫吸附(ELISA)实验检测巨噬细胞上清液中M1型极化因子TNF-α和IL-6的含量;应用蛋白质免疫印记(WB)实验检测巨噬细胞中FKN、Wnt/β-catenin通路关键因子Wnt-4和β-catenin、M1型极化因子iNOS、TNF-α和IL-6的蛋白表达水平;应用免疫荧光(IF)实验检测巨噬细胞中M1型极化因子IL-6蛋白的定位。结果 过表达FKN的RAW264.7细胞中FKN的蛋白水平较空白对照组明显升高(P<0.01)。CCK-8实验显示ICG-001作用于RAW264.7细胞48 h的IC50为10 μmol/mL。与LPS组相比,ICG-001+LPS组上清液中TNF-α和IL-6的分泌量以及细胞内TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量均升高(P<0.05),而细胞内FKN、Wnt-4和β-catenin蛋白含量均显著降低(P<0.01);EXFKN+LPS组上清液中TNF-α和IL-6的分泌量以及细胞内TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量均显著降低(P<0.01),而细胞内FKN、Wnt-4和β-catenin蛋白含量均显著升高(P<0.01)。与LPS组相比,ICG-001+LPS组中IL-6在细胞质中的定位增强,而EXFKN+LPS组中IL-6在细胞质中的定位受到抑制。结论 过表达FKN通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制脂多糖诱导的巨噬细胞M1型极化。