南方医科大学学报

南方医科大学学报 ›› 2006, Vol. 26 ›› Issue (12): 1715-1719.

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靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建

王全师； 王欣璐； 李华； 王巧愚； 王全颖； 杨广笑；   

  1. 南方医科大学南方医院PET中心； 广州军区广州总医院核医学科PET中心； 中山大学附属第三医院； 西安华广生物工程公司； 西安华广生物工程公司 广东广州510515； 广东广州510010； 广东广州510630； 广东广州510515； 陕西西安710025；
  • 出版日期:2006-12-20 发布日期:2006-12-20
  • 基金资助:
    国家自然科学基金(30370426,30500136);广东省科技计划项目(2003C32729);广东省自然科学基金(06021352)~~

Construction of a retroviral vector for RNA interference targeting human telomerase reverse transcriptase

WANG Quan-shi1,WANG Xin-lu2,LI Hua3,WANG Qiao-yu1,WANG Quan-ying4,YANG Guang-xiao4 1PET Center,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2PET Center of Department of Nuclear Medicine,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command,Guangzhou 510010,China;3Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,China;4Xi’an Huaguang Bioengineering Company,Xi’an 710025,China   

  1. 南方医科大学南方医院PET中心； 广州军区广州总医院核医学科PET中心； 中山大学附属第三医院； 西安华广生物工程公司； 西安华广生物工程公司 广东广州510515； 广东广州510010； 广东广州510630； 广东广州510515； 陕西西安710025；
  • Online:2006-12-20 Published:2006-12-20

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摘要： 目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。

Abstract: Objective To construct a recombinant retroviral vector for RNA interference targeting human telomerase reverse transcriptase(hTERT).Methods The sequences coding for enhanced fluorescence protein(EGFP),U6 promoter and a small interfering RNA(siRNA)targeting hTERT were amplified by PCR,respectively,and sub-cloned sequentially into the retroviral shuttle plasmid pLXSN to construct the plasmid pLXSN-EGFP-U6-siTERT.The recombinant expression plasmid was identified by restriction enzyme digestion and sequencing.Fluorescence microscopy and flow cytometry were employed to analyze EGFP expression in NIH3T3 transfected with the recombinant plasmid,and MMT assay was performed to evaluate the growth inhibition of Hela cells resulting from RNA interference mediated by the plasmid.Results Sequence analysis and restriction enzyme digestion showed that the recombinant expression plasmid pLXSN-EGFP-U6-siTERT was constructed successfully.Twenty-four hours after transfection of NIH3T3 cells with the recombinant plasmid,the expression rate of EGFP reached 24.1% as shown by flow cytometry.MTT assay demonstrated a cell death rate of 53.2% 72 h after transfection of Hela cells with the plasmid.Conclusion The successful construction of the recombinant retroviral plasmid mediating potent cell growth inhibition suggests the great potential of RNA interference technique in suppressing hTERT expression in mammalian tumor cells.

中图分类号: