南方医科大学学报 ›› 2006, Vol. 26 ›› Issue (09): 1263-1268.
杨佩; 王坤正; 时志斌; 党晓谦; 余鹏博; 王春生; 宫福良;
YANG Pei1, WANG Kun-zheng1, SHI Zhi-bin1, DANG Xiao-qian1, YU Peng-bo2, WANG Chun-sheng1, GONG Fu-liang3 1Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China; 2Institute of Virus Research, Center for Disease Control and Prevention of Shaanxi Province, Xi’an 710054, China; 3Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China
摘要: 目的用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子(VEGF165),分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性,为后期构建携带VEGF165蛋白的预成血管化组织工程骨提供充足的蛋白来源。方法利用PCR亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2+-NTA进行蛋白纯化。酶联免疫吸附(ELISA)和Westernblot技术检测纯化的VEGF165蛋白免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。结果重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功的表达了相对分子质量为23000的蛋白,该蛋白以不溶性包涵体的形式存在,占菌体总蛋白的30%左右。经过分离和Ni柱纯化获得了VEGF165蛋白,浓度约为0.2mg/ml,ELISA和Westernblot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验显示所表达的蛋白具有良好的生物学活性。结论本实验在原核细胞中稳定、高效的表达了具有活性的VEGF165蛋白,为后期预购血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。
中图分类号: