人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

南方医科大学学报 ›› 2004, Vol. 24 ›› Issue (08): 913-916.

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

别俊¹, 孙茂盛², 孙强明², 郑建平³, 孙雯佳²

1. 昆明医学院研究生部, 云南, 昆明, 650031;
2. 中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室, 云南, 昆明, 650118;
3. 昆明市延安医院, 云南, 昆明, 650023

出版日期:2004-08-20 发布日期:2004-08-20
基金资助:
收稿日期:2003-8-26。
作者简介:别俊(1976-),男,昆明医学院在读硕士研究生,电话:0871-8334401,E-mail:bj520307@sina.com
通讯作者:孙茂盛,中国医学科学院医学生物研究所副所长,电话:0871-8334326,E-mail:maoshs@public.km.yn.cn

Cloning, expression and identification of human survivin in E.coli

BIE Jun¹, SUN Mao-sheng², SUN Qiang-ming², ZHENG Jian-ping³, SUN Wen-jia²

1. 昆明医学院研究生部, 云南, 昆明, 650031;
2. 中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室, 云南, 昆明, 650118;
3. 昆明市延安医院, 云南, 昆明, 650023

Online:2004-08-20 Published:2004-08-20

摘要/Abstract

摘要： 目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果 PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coli Bl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。

Abstract: Objective To efficiently express and identify recombinant human survivin in E.coli. Methods Survivin cDNA was amplified by reverse transcriptional (RT)-PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pBV220, followed by expression of the recombinant plasmid in E.coli strain BL21 (Gold). To obtain survivin protein, DEAE-Sepharose Fast-Flow ion exchange chromatography and Sephacryl S-200 gel filtration were performed. Western blot analysis was used for detecting the expressed product. Results Survivin protein was expressed in E.coli in the form of inclusion body at the expression level over 30% of the total cell protein. After ion exchange chromatography and gel filtration, the recombinant protein reached a purity over 95% and exhibited specific reaction with mouse anti-human antibody. Conclusion Survivin protein with high purity can be obtained by the method described above to facilitate further study of the anti-apoptosis function of survivin.

中图分类号:

别俊¹, 孙茂盛², 孙强明², 郑建平³, 孙雯佳². 人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定[J]. 南方医科大学学报, 2004, 24(08): 913-916.

BIE Jun¹, SUN Mao-sheng², SUN Qiang-ming², ZHENG Jian-ping³, SUN Wen-jia². Cloning, expression and identification of human survivin in E.coli[J]. Journal of Southern Medical University, 2004, 24(08): 913-916.

参考文献

[1] Li F, Ambrosini, Chu EY. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin[J]. Nature, 1998, 396: 580-4.
[2] Adida C, Crotty PL, Mcgrath J, et al. Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse proliferation[J]. Am J Pathol, 1998, 152(1): 43.
[3] Carter BZ, Milella M, Altieri DC, et al. Cytokine-regulated expression of survivin in myeloid leukemia[J]. Blood, 2001, 97: 2784-90.
[4] Suzuki A, Ito T, Kawano H, et al. Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J]. Oncogene, 2000, 19: 1346-53.
[5] Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. Anti-apoptosis protein human survivin is a direct inhibitor or Caspase -3 and -7[J]. Biochemistry,2001, 40:1117-23.
[6] Olie RA, Simoes AP, Baumann B, et al. A novel antisense oligonucleotide tatgeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cell to chemotherapy[J]. Cancer Res, 2000,60 (11): 2805-9.
[7] Grazia, Ambrosini, Colette A, et al. Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation by survivin gene targeting[J]. J Biol Chem, 1998, 273: 11177-82.
[8] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].北京:中国协和医科大学出版社,1990.400-3.
[9] Lu CD, Altieri DC, Tanigana N. Nobuniko Tanigana. Expression of a novel antiapoptosis gene, survivin, correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas[J]. Cancer Res,1998, 58(9): 1808-12.
[10] 张智清,姚立红,侯云德.含pRpL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J].病毒学报[Vins Acta(China)],1990,6:111-5.
[11] 熊绍虎,余磊,谭海燕,等.重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化[J].第一军医大学学报,2002,22(5):413-6.Xiong SH, Yu L, Tan HY, et al. Expression and purification of recombinent bone morphogenetic protein-2 in E.coli[J]. J First Mil Med Univ/Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 2002, 22(5): 413-6.
[12] 周最民,郭亚兵,王战会,等.人微球蛋白基因在大肠杆菌中的稳定、高效表达[J].第一军医大学学报,2002,22(11):986-91.Zhou ZM, Guo YB, Wang ZH, et al. Efficient and constant expression of cloned human β2-microglobulin gene in E.coli[J]. J First Mil Med Univ/Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 2002, 22 (11):986-91.

[1]	张雷；陈建平；张莉；王涛；刘明杰；田玉； . mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(12): 1701-1705.
[2]	王全师；王欣璐；李华；王巧愚；王全颖；杨广笑； . 靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(12): 1715-1719.
[3]	李德良；马文丽；师永霞；李凌；张宝；郑文岭； . HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(12): 1724-1727.
[4]	袁瑷芹；何援利；杨芳；刘木彪； . 携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(12): 1769-1771.
[5]	蒋鸿超；孙强明；赵丹；孙茂盛；吕琳；李鸿钧； . 靶向survivin的siRNA表达载体的构建和表达及对HeLa细胞的影响[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(12): 1806-1811.
[6]	邵紫韫；刘志锋；彭毅；徐佳；邓鹏；姜勇；. IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(11): 1552-1555.
[7]	马树东；罗荣城；丁振华；袁长青；丁雪梅；. Her2/neu膜外及跨膜区蛋白基因重组腺病毒的构建和鉴定[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(11): 1641-.
[8]	李海玉；郭爱华；刘志锋；刘瑜；刘靖华；邓鹏；李志杰；刘亚伟；姜勇；. 细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(10): 1394-.
[9]	杨佩；王坤正；时志斌；党晓谦；余鹏博；王春生；宫福良；. 血管内皮生长因子在原核细胞中的高效表达、纯化与活性研究(英文)[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(09): 1263-1268.
[10]	邢锐；杨晓强；陈学清；张振书；. 重组人TFF2乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(09): 1280-1283.
[11]	任淑婷；于琳华；徐长福；高广道；. 诱导性鼠Smad7真核表达载体的构建与鉴定[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(09): 1313-1315.
[12]	董晓；王家宁；黄永章；郭凌郧；. PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(08): 1114-1117.
[13]	刘明杰；陈建平；王涛；廖涛；陈宪；芦殿香；田玉；. PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(07): 904-909.
[14]	李岩；鲍朗；张会东；李娅莎；朱海龙；. 表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(07): 923-926.
[15]	邹红云；马骊；姚新生；温茜；罗微；王小宁；. Jurkat细胞TCR基因重排对BV CDR3的影响[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(07): 939-943.