南方医科大学学报 ›› 2024, Vol. 44 ›› Issue (2): 236-243.doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2024.02.05
李洋洋,徐佳佳,姜诚诚,陈子龙,陈 颖,应梦娇,王 澳,马彩云,王春景,郭 俣,刘长青
LI Yangyang, XU Jiajia, JIANG Chengcheng, CHEN Zilong, CHEN Ying, YING Mengjiao, WANG Ao, MA Caiyun, WANG Chunjing, GUO Yu, LIU Changqing
摘要: 目的 提高人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞(hiPSCs-NECs)定向诱导中脑多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的效率。方法 将人iPSCs在含有小分子组合[DMH1(10 μmol/L)、SB431542(10 μmol/L)、音猬因子(SHH 200 ng/mL)、成纤维细胞生长因8(FGF8 100 ng/mL)、嘌吗啡胺(2 μmol/L)、CHIR99021(3 μmol/L)、N2(1%)]的mTeSRTM培养基中诱导至12 d,细胞分化为原始神经上皮细胞(NECs)。特异性诱导DAPs,将诱导的hiPSCs-NECs用胶原酶IV消化后,在神经分化培养基[添加 1%N2、2%B27-A、BDNF(10 ng/mL)、GDNF(10 ng/mL)、AA、TGF-β、cAMP、1% GlutaMax]中加入不同浓度的Rho激酶抑制剂Y27632重新接种,并于次日更换培养基去除Y27632,持续诱导至第28天获得DAPs。结果 人iPSCs可在基质胶上稳定传代,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得hiPSCs-NECs,形成玫瑰花结样结构,能够表达特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6)。将hiPSCs-NECs消化后,添加5 μmol/L Y27632的hiPSCs-NECs相比较未加Y27632的对照组,细胞解离后贴壁存活率明显增加,处于S期的细胞(P<0.01)与细胞活力显著提高(P<0.01),且凋亡率显著降低(P<0.05),持续诱导至第28天,细胞高表达DAPs特异性的标记物(TH、FOXA2、NURR1和Tuj1)。结论 添加Y27632(5 μmol/L)24 h可显著提高人iPSCs-NECs细胞向iPSCs-DA神经前体转化时的细胞存活率,并且Y27632去除后,不会影响后续向DA神经前体细胞分化,间接的提高了细胞的分化效率。