肝癌是世界上最致命的癌症之一，是男性因癌症死亡的第3大原因，而在女性中位列第6^[1]。原发性肝癌起源于肝脏上皮或间叶组织，根据不同组织学类型可分为胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤和肝细胞癌（HCC）^[2]。HCC是最常见的肝癌类型，约占70%~85%^[3]。现在的研究认为，慢性炎症、病毒感染、酗酒和糖尿病与HCC发生密切相关^[4-5]，然而其具体发病机制仍不清楚。临床肝癌的主要治疗策略为手术切除和原位肝移植，然而大多数患者的总体预后仍然很差，五年内复发或转移发生率高达75%~100%^[6]。由于HCC诊断多为晚期，且目前的治疗方法在改善预后的效果仍不理想，探索HCC的有效治疗药物一直是该领域的研究的热点和难点。

近年来，中医药在肿瘤预防领域的作用越来越受到重视, 而且已有大量研究证实某些中药在一定程度上起到防治肝癌的作用^[7-9]。鳖甲煎丸（BJJ）是东汉名医张仲景在《金匮要略》中记载的经典方剂，该方配伍药物众多，主要包括为鳖甲、阿胶、鼠妇虫、蜂房、土鳖虫、蜣螂、黄芩、人参等^[10]。鳖甲煎丸中医上是治疗癥瘕、疟母的经典方剂，现在的研究发现鳖甲煎丸具有抗纤维化，包括肝纤维化，肾间质纤维化和肺纤维化的作用，并且对高血脂，动脉粥样硬化也有很好的疗效^[11-13]。此外，在肿瘤相关研究中，鳖甲煎丸已被证实可在小鼠荷瘤肝癌模型上抑制肿瘤生长和肿瘤组织血管生成，具有显著抑制效果^[14-15]。然而，鳖甲煎丸防治肝癌的具体机制仍不清楚。

二乙基亚硝胺（DEN）是诱导啮齿类动物原发性肝癌的常用化学药物，DEN可使动物体内产生自由基，造成机体氧化损伤，伴随炎症反应可引起动物从肝纤维化至肝硬化向肿瘤的病理发展，是分析肝癌炎症相关发病机制的理想动物模型^[16]。慢性肝损伤发展过程中炎症的持续反应是肝癌发生的重要因素，活性氧簇（ROS）-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体信号通路已被证明在肝脏的炎症损伤中发挥重要作用，NLRP3炎症小体的激活与肝损伤及肝纤维化具有密切联系^[17]。本研究通过DEN处理大鼠建立原发性肝癌模型，拟初步探索鳖甲煎丸对原发性肝癌发生发展的抑制作用及其潜在机制。

65只雄性SD大鼠购自南方医科大学动物实验中心，体质量200~230 g，生产许可证号为SCXK（粤）2019- 0011，使用许可证号SYXK（粤）2019-0022。实验动物在标准清洁级环境下喂养，温度21±2 ℃，湿度（60±5）%，12 h的暗光循环。实验动物可自由摄取食物和水。本实验通过南方医科大学伦理委员会委员会审查，并遵从动物实验3R原则。

鳖甲煎丸溶液由本实验室配置。HE染液试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和总胆红素（TBIL）测定ELISA试剂盒（鲁纹生物）；Masson's trichrome Kit（Biosis）；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和胱甘肽过氧化物酶（GPX）和丙二醛（MDA）测定试剂盒（金斯瑞生物）。总蛋白提取及BCA蛋白定量试剂盒（碧云天），ECL发光液、硝酸纤维素膜（Merck Millipore）。Western blotting实验所用一抗（cell signaling technology0，二抗（中杉金桥）。

65只SD大鼠随机分为5组：对照组、DEN造模组、鳖甲煎丸低剂量组（DEN-BJJ-L）组、鳖甲煎丸中剂量组（DEN-BJJ-M）和鳖甲煎丸高剂量组（DEN-BJJ-H）组，每组13只。对照组大鼠每周3次腹腔注射生理盐水，其他组大鼠腹腔注射DEN（50 mg/kg），每周3次，共给药16周。鳖甲煎丸治疗组第5周开始每天鳖甲煎丸溶液灌胃，DEN-BJJ-L组0.55 g/（kg·d），DEN-BJJ-M组1.1 g/（kg·d），DEN-BJJ-H组为高剂量2.2 g/（kg·d），对照组及DEN组每天等体积PBS灌胃。最后一次给药后1周，大鼠通过过量麻醉处死，打开腹腔后取出肝脏，观察并记录或用于组织学染色和生化检测。

肝脏组织在4%甲醛溶液中浸泡过夜进行固定，随后包埋在石蜡中，切成5 μm厚的切片进行HE染色。Masson染色石蜡切片制作法与HE染色相同，切片制作后根据说明书进行Masson染色，树胶封闭后显微镜拍照。

肝脏组织切块加入Tris-HCl缓冲液，在4 ℃下组织匀浆，用等量的乙醇提取上清液，2500 r/min离心10 min。取上清液后用PBS溶液5倍稀释，用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，加入50 μL样品，根据ELISA试剂盒实验说明书操作，经加样、孵育、洗板、显色、读板等步骤测量肝组织中SOD酶、GPX酶、CAT酶活性以及MDA含量。

血液样本1000 g离心10 min，取上清液后用PBS溶液5倍稀释，用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，加入50 μL样品，根据ELISA试剂盒实验说明书操作，经加样、孵育、洗板、显色、读板等步骤测量血清中ALT、AST、ALP和TBIL水平。

肝组织匀浆后加入RIPA裂解液裂解，离心后取上清，利用BCA试剂盒蛋白统一定量，全蛋白通过SDSPAGE电泳分离。电泳结束后，蛋白质电转移至硝酸纤维素膜，随后加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h。封闭结束后加入一抗（anti-cleaved caspase-3 1 :1000，anti-pro cleaved caspase-3 1:1000，anti-NLRP3 1:500，anti-ASC 1:200，anti-GAPDH 1:500）室温孵育2 h，随后4 ℃过夜。第2天，TBST洗膜后HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL法显影后，Quantity One软件分析条带的灰度值。

实验数据均采用均数±标准差表示，Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析方法进行多组定量资料的比较，当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

图 1(Fig.1)

图 1 大鼠DEN造模并给予鳖甲煎丸处理后肝脏形态学结果 Fig.1 Morphological observation of the liver of the rats after Den modeling and BJJ treatment. Con: Normal liver; DEN: DENinjured liver. The rats in DEN+BJJ+L, DEN+BJJ+M, and DEN+BJJ+H groups were treated with BJJ at 0.55, 1.1 and 2.2 mg/kg BJJ after modeling, respectively (n=13).

在造模并给药16周后对大鼠肝脏和血液组织进行取样检测。对各组肝脏的形态观察结果显示：对照组大鼠肝脏质地柔软，表面光滑无结节，呈红褐色，而DEN处理组大鼠肝脏可观察到明显的肿瘤生长，结节数目增多且大小不一，肝脏高度纤维化，颜色为黄褐色。经过鳖甲煎丸处理后，肝脏结节化的程度随鳖甲煎丸浓度的增高而降低，肝脏表面逐渐平滑，肿瘤生长程度逐渐降低，颜色趋于正常肝脏颜色。

HE染色结果显示（图 2A），正常的肝脏组织内肝叶结构完整，肝细胞排列整齐。DEN处理后的组肝小叶结构有不同程度的破坏，小叶内可见局灶性细胞坏死，伴有不同程度的炎细胞浸润和纤维化。鳖甲煎丸低剂量组大鼠肝组织细胞损伤程度仍然较高，可见假小叶形成和部分非典型性癌细胞，多见炎细胞浸润；随着处理剂量升高，高剂量鳖甲煎丸处理组大鼠肝组织纤维化程度低，未见明显的假小叶形成，癌变细胞较少，炎细胞浸润减少。Masson染色证明了同样的结果（图 2B），同时可观察到DEN处理后大鼠肝实质中胶原沉积程度明显加强，而高剂量鳖甲煎丸处理可显著降低肝组织中胶原沉积。

图 2(Fig.2)

图 2 鳖甲煎丸减轻SD大鼠由DEN损伤的HE和Masson染色结果 Fig.2 BJJ attenuates hepatic fibrosis and inhibits carcinogenesis in DEN-injured SD rats. A: HE staining of the liver tissues; B: Masson staining of the liver tissues. Scale bar=100 μm.

DEN处理可显著增加大鼠血清中ALT（图 3A，P＜0.001）、AST（图 3B，P＜0.01）、ALP（图 3C，P＜0.001）和TBIL（图 3D，P＜0.001）含量，而中高剂量鳖甲煎丸可显著降低以上肝功能指标在DEN处理后大鼠血清中的含量，指标接近于对照组水平。

图 3(Fig.3)

图 3 鳖甲煎丸对DEN处理后大鼠肝功能的影响 Fig.3 Protective effects of BJJ on liver function after DEN treatment (Mean±SD, n=8). ELISA was used to detect the serum levels of ALT (A), AST (B), ALP (C) and TBIL (D). ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs Con group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs DEN group.

相比于对照组，经DEN处理后，SOD（图 4A，P＜0.001）、CAT（图 4B，P＜0.001）、GPX（图 4C，P＜0.001）含量显著降低而MDA（图 4D，P＜0.001）浓度显著增高。

图 4(Fig.4)

图 4 鳖甲煎丸对DEN处理的大鼠肝组织抗氧化酶和过氧化物活性或含量的影响 Fig.4 Effects of BJJ on the concentration of antioxidant enzymes and hyperoxide in the liver tissues of rats after DEN treatment. A: SOD; B: CAT; C: GPX and D: MDA concentration in the liver tissue. Mean±SD, n=10. ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs Con group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DEN group.

DEN处理后大鼠肝组织中NLRP3（图 5A，P＜0.001）、ASC（图 5B，P＜0.001）和cleaved caspase-1（图 5C，P＜0.001）表达显著升高，而随鳖甲煎丸处理剂量升高可逐渐降低NLRP3、ASC和cleaved caspase-1表达，并在最大剂量时抑制效果最为明显，DEN处理后pro cleaved caspase-1表达并无显著变化。鳖甲煎丸处理可显著降低肝脏中pro-IL-1β（图 5E，P＜0.01）、pro-IL-18（图 5F，P＜0.001）、IL-1β（图 5G，P＜0.001）和IL-18（图 5H，P＜0.001）表达水平，且呈现剂量依赖相关。

图 5(Fig.5)

图 5 鳖甲煎丸对肝癌组织中炎症小体通路相关分子表达的影响 Fig.5 Effects of BJJ on NLRP3 inflammasomes in the liver tissues of the Den-treated rats. A: Western blotting results. Statistical results of NLRP3 (B), ASC (C) and cleaved caspase-1/pro cleaved caspase- 1 ratio (D) and ELISA results of pro-IL-1β (E), pro-IL-18 (F), IL-1β (G), and IL-18 (H) are shown. Mean±SD, n=10. ###P < 0.001 vs Con group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs DEN group.

HCC是发生于肝脏的原发性肝癌，每年新增的HCC病例约50%发生在中国^[18]。现在的研究发现乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒（HBV/HCV）感染、遗传变异或肝硬化等是HCC的主要发生因素^[19]。在中国，肝癌是仅次于肺癌的男性癌症相关死亡的第二常见原因^[20]。手术切除加放化疗是治疗HCC的有效手段，然而约80%的肝癌患者初步诊断时已为晚期，无法接受手术^[21]。HCC术后复发率和转移率较高，因此，寻找新的诊断和治疗策略至关重要，而近年来中草药在防癌抗癌的效果吸引了众多研究人员的目光。鳖甲煎丸是东汉名医张仲景在《金匮要略》中记载的经典药方，其用药众多，是治疗疟母的主方。现在临床中医主要用于慢性肝病、高血脂、心绞痛等治疗^[22]。本研究发现鳖甲煎丸可抑制DEN诱导大鼠肝癌生长，降低肝功能损伤，降低肝脏氧化应激水平，Western blotting实验结果显示，鳖甲煎丸显著抑制了NLRP3炎症小体相关通路的表达。

现在的研究发现，鳖甲煎丸具有抗肿瘤作用。张绪慧等^[15]报道，鳖甲煎丸可显著抑制H22荷瘤小鼠体内瘤体组织生长，陈达理^[23]曾报道鳖甲煎丸可抑制肿瘤组织血管生成。罗庆东等^[14]报道鳖甲煎丸对肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长及转移具有抑制作用。我们的实验结果显示，DEN处理大鼠16周后，鳖甲煎丸可显著抑制大鼠肝脏肿瘤发生，这与以往研究所报道的鳖甲煎丸具有在体内外的抗肝癌细胞生长的作用相一致^[24-25]。同时H&E和Masson染色结果显示，鳖甲煎丸可降低大鼠肝组织纤维化程度，减少癌变细胞和炎性细胞浸润，而现有的医学证据显示，阻断或者逆转肝纤维化有助于肝硬化、肝癌的防治，而我们的结果提示了鳖甲煎丸可具有确切的抗肝纤维化、抗肝硬化的作用，从而可一定程度上延缓肝脏从肝硬化进展至肝细胞癌的进程，这与李红等人的研究结论相一致^[26]。肝癌发生会导致肝损伤，严重影响肝功能，ALT、AST、ALP和TBIL是衡量肝脏功能的重要指标。ELISA实验结果显示，鳖甲煎丸可显著降低大鼠血清中ALT、AST、ALP和TBIL含量，说明鳖甲煎丸可降低肝癌发生过程中肝脏损伤，维持肝脏正常功能。SOD、CAT、GPX是机体重要的抗氧化酶，有减缓氧化速度、清除机体过氧化物的能力；MDA是脂质过氧化物，可反映机体内脂质过氧化程度。肝癌发生后肝脏氧化应激升高，肝细胞清除过氧化物能力下降^[27]。本研究中我们发现，DEN处理显著降低了大鼠肝脏组织清除过氧化物能力，这提示DEN可通过降低肝脏的抗氧化能力而导致肝癌的发生，而给予鳖甲煎丸后，SOD、CAT和GPX含量显著升高，MDA水平降低，氧化应激水平的降低降低了局部组织内的炎症反应，鳖甲煎对肝脏的抗氧化能力的增强可抑制癌变过程中的炎症环节，对抗癌效果具有积极作用。

炎症小体是细胞中大分子蛋白质的聚集体，可促进炎症细胞因子成熟^[28]。NLRP3是目前研究最广泛的炎症小体，NLRP3炎性体活化后，先由胞外刺激诱导NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β表达，随后NLRP3、pro-caspase-1与凋亡相关点样蛋白（ASC）形成炎性体蛋白单体，再由DAMP诱导组装成炎性体多聚体，发挥活性作用，促进IL-1β、IL-18剪切成熟并分泌^[29-30]。NLRP3炎症小体在多种肿瘤发生过程中具有重要作用，其中就包括HCC，在本研究中我们认为鳖甲煎丸可通过调控NLRP3炎症小体抑制HCC发生。以往有文献报道，在HCC中，NLRP3炎症小体中蛋白分子与正常肝脏相比显著增加^[31]，而靶向NLRP3炎症小体可抑制肿瘤的增殖和转移^[32]。与之相一致的是，在本研究中我们发现，DEN处理后大鼠NLRP3、ASC和caspase-1及相关炎症因子表达显著上升，而鳖甲煎丸处理可显著降低NLRP3炎症小体中相关信号分子表达水平，且各分子呈现一致性并呈剂量相关性，这提示我们，鳖甲煎丸可能通过降低炎症小体NLRP3的活化表达，从而进一步抑制由DEN造成的肝脏细胞癌变损伤，发挥其对肝脏组织的保护作用。在此工作中，主要重点是对鳖甲煎丸对DEN诱导原发性肝癌这一病理进程的是否具有抑制作用进行验证，并对其潜在机制进行探讨。由于鳖甲煎丸为一多成分混合药物，其可能存在多个作用靶点，故在设计因果实验实施较为困难，并且难以解释，我们在设计中选用的是剂量依赖与治疗效果相结合观察，可发现鳖甲煎丸的剂量依赖性作用效果及相关通路机制的强相关性，从而对其发挥作用的机制进行前期探索。

综上所述，本研究证明鳖甲煎丸可抑制大鼠DEN诱导肝癌生长，并降低肝脏损伤，维持肝脏正常功能。肝脏抗氧化能力增强和降低NLRP3炎症小体相关信号通路的表达是鳖甲煎丸可发挥治疗作用的作用靶点。