支气管哮喘（简称哮喘）是一种由多种细胞介导的慢性气道炎症，气道高反应性（AHR）是其重要的病理生理学特征^[1-2]。支气管激发试验（BPT）是临床上最常用的测定和了解AHR的检测方式，对哮喘的诊断及鉴别诊断、病情判断、药物疗效评价等都具有重要意义^[3-4]。BPT根据刺激物的作用机制分为直接和间接BPT，目前临床上应用较多的是乙酰甲胆碱（MCH）直接BPT，此检测方法简单易行，程序标准化，且敏感性高，但仍有一定的局限性，如对临床疾病的诊断及鉴别诊断特异性不高^[2]。白三烯D4（LTD4）是参与哮喘气道炎症的最重要介质之一，能引起气道平滑肌的收缩，可作为一种高效、敏感的激发剂^[5-6]。已有研究报道过成人白三烯BPT的方法及应用价值^[7-8]，但针对儿童的白三烯BPT及其应用尚未见报道。因此，本研究拟探讨以LTD4作为激发剂的儿童BPT，并与常规BPT（MCH-BPT）进行比较，初步探讨哮喘患儿对LTD4的气道敏感性、LTD4-BPT主要不良反应及在儿童中应用的安全性、两种BPT在气道反应性检测方面是否有差异及对哮喘的诊断及排除诊断是否有不同的意义。

选取我院呼吸专科门诊2017年11月~2018年8月期间就诊的患儿，年龄6~14岁，性别不限。其中哮喘缓解期患儿86例，纳入标准^[1]：符合儿童哮喘诊断标准（呼吸道症状、体征及肺功能检查，证实存在可变的呼气气流受限，除外引起相关症状的其他疾病），经哮喘规范化治疗后处于临床缓解期的患儿，病程2年内；急支复查患儿65例，纳入标准^[9]：门诊就诊符合《诸福棠实用儿科学》关于急性支气管炎的诊断标准（咳嗽、咳痰、发热、肺部痰鸣音及X线胸肺纹理增加）；经正规治疗无临床症状，4周复查时患儿肺部体检无阳性体征。

排除标准：（1）慢性基础疾病，如支气管肺发育不良、神经系统疾病、先天性心脏病、自身免疫性疾病等；（2）近4周内有呼吸道感染；（3）试验前使用了可能干扰气道反应性的药物；（4）BPT检测的禁忌症^[10]：如对激发剂过敏、基础肺功能中度以上损害（FEV1 < 70%预计值）、不能解释的荨麻疹、不宜做用力肺功能检查的患儿^[11]。

以上患儿配合良好，家长依从性好，愿意接受调查，并签署《支气管激发试验知情同意书》；研究方案获得我院伦理委员会的批准（批准号：071/2017）。

入组的研究对象均行BPT检测，按吸入激发剂的种类不同，分为LTD4组和MCH组；其中LTD4组BPT检测结果为阴性的哮喘患儿洗脱后行MCH-BPT检测（图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 试验分组及干预方式流程图 Fig.1 Flow chart of trial grouping and intervention.

肺功能仪MasterScreen Paed（JAEGER）、APS pro自动雾化装置（JAEGER）、LTD4（Cayman）、MCH（Sigma）、硫酸特布他林雾化液（AstraZeneca）、95%无水乙醇（重庆川东化工）、生理盐水（四川科伦药业）。

所有BPT检测均由同一操作人员在同一时间段同一台仪器上完成，且使用同一批次的试剂，保证试验的同质性。

试验方法参考文献[7-8]。①激发剂的存储及配制：LTD4原液浓度为100 μg/mL（LTD4溶解于95%无水乙醇中），用微量移液管吸取200 μL LTD4原液，添加1050 μL生理盐水配成16 μg/mL LTD4稀释液（A溶液）；取500 μLA溶液，向其中添加500 μL生理盐水配成8 μg/mL稀释液(B溶液)。LTD4原液保存于-80 ℃，LTD4稀释液遵循“现用现配”的原则，试验当天配制、使用，当天未用完的稀释液弃之。对照液的配制：200 μL 95%无水乙醇，添加1050 μL生理盐水配成16%乙醇对照液（16 μg/mL的LTD4溶液其乙醇浓度为16%）；②操作步骤：肺通气功能测定，检测方法严格参照《儿童肺功能系列指南（二）：肺容积和通气功能》^[11]的质控要求，取最佳值为基线值；通过APS自动触发雾化吸入16%乙醇对照液5吸，30 S重复测定吸入稀释液后的肺通气功能，如果FEV1下降 < 10%继续检测；如果FEV1下降10%~20%之间，重复测定1~2次，若FEV1无进行性下降，则继续；若FEV1进行性下降，则剔除该试验对象并吸入支气管舒张剂；经APS雾化器由低浓度至高浓度依次吸入LTD4稀释液，每一剂量吸入后5 min重复检测肺通气功能，直至FEV1下降较基线值≥20%或吸入最高浓度，终止激发；记录患儿的不良反应，BPT检测结果阳性的患儿吸入支气管舒张剂后复查肺通气功能，FEV1恢复至基线值，试验结束（表 1）。

表 1(Tab.1)

表 1 气雾激发系统吸入LTD4规程 Tab.1 Procedures for inhalation of LTD4 by aerosol excitation system Procedure Concentration (Mg/mL) Inhalation times (times) Inhalation time (s) Dose (μg) Cumulative dose (μg) R1 - R2 16% alcohol 5 0.375 1.2×103 P3 8 (solution B) 2 0.5859 0.0375 0.0375 P4 8 (solution B) 5 0.7031 0.1125 0.150 P5 16 (solution A) 6 0.8789 0.45 0.600 P6 16 (solution A) 8 0.8789 0.6 1.200 D7 Bronchodilator

表 1 气雾激发系统吸入LTD4规程 Tab.1 Procedures for inhalation of LTD4 by aerosol excitation system

参照《儿童肺功能系列指南（六）：支气管激发试验》进行操作及质量控制^[10]。操作步骤：测定肺通气功能基线值（同LTD4-BPT）；经APS雾化器依次吸入对照剂（9 g/L盐水）及由低浓度量至高浓度的MCH，每一剂量吸入后2 min重复检测肺通气功能，直至FEV1下降较基线值≥20%或吸入最高浓度和剂量，停止激发试验，记录患儿的不良反应，吸入支气管舒张剂后复查肺通气功能，FEV1恢复至基线值，试验结束。

LTD4-BPT检测结果为阴性的哮喘患儿，检测结束2 h后，行肺通气功能检测，如各项肺通气功能指标与LTD4-BPT基础肺通气功能比较差异在5%以内，对这部分患儿再次行MCH-BPT检测（检测方法同上）。

参考指南^[10]及文献7进行判断，以FEV1下降20%时的累积剂量（provoking dose, PD20FEV1）评定气道反应性。①BPT定性判断：LTD4组：FEV1下降≥20%且PD20FEV1≤1.200 ug判定为阳性；MCH组：FEV1下降≥20%且PD20FEV1≤2.500 mg判定为阳性；未达到激发阳性的标准则为激发试验阴性；②MCH-BPT定量判断：参照指南^[10]对AHR进行严重度分级。

采用SPSS 25.0统计学软件进行分析，计量资料以均值±标准差表示，采用单因素方差分析；正态分布资料组间比较采用两独立样本t检验。计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验进行R×C列表比较。利用受试者工作特征（ROC）曲线对LTD4-BPT和MCH-BPT的诊断学价值进行评估，并计算曲线下面积及其95%置信空间。P < 0.05为差异有统计学意义。

纳入的151例患儿均完成了BPT检测，且检测数据均符合质控要求，男98例，女53例，年龄6~13.6岁，平均年龄（8.23±1.89）岁，身高（129.57±13.67）cm，体质量（29.89±11.20）kg，哮喘病史1~2年，LTD4组与MCH组一般资料比较无统计学差异（P>0.05，表 2）。

表 2(Tab.2)

表 2 一般资料比较 Tab.2 Comparison of general information Group Number Male/Female Age (year) Height (cm) Body mass(kg) Allergy history#[%(n)] LTD4 78 50/28 8.19±1.96 128.58±13.91 29.69±11.36 74.3% (58) MCH 73 48/25 8.26±1.87 130.45±13.53 30.06±11.17 71.2% (52) Statistical value 0.045 0.315 0.446 0.026 0.327 P 0.832 0.754 0.506 0.873 0.567 #History of allergies include eczema, allergic rhinitis, other history of allergic diseases and positive results of any allergen test.

表 2 一般资料比较 Tab.2 Comparison of general information

LTD4组与MCH组患儿基础肺功能检测结果无显著性差异（P>0.05，表 3）。BPT结果，LTD4组哮喘患儿阳性率明显低于MCH组（P < 0.05）；LTD4组和MCH组哮喘患儿的阳性率明显高于急支复查患儿（P < 0.05，表 4）。

表 3(Tab.3)

表 3 BPT基础肺功能比较 Tab.3 Comparison of basic pulmonary function following BPT (Mean±SD) Pulmonary function parameters Group Statistics LTD4 Group MCH Group t P FVC (%) 103.45±10.72 101.60±12.36 0.779 0.438 FEV1 (%) 105.26±12.76 102.89±13.26 0.891 0.375 FEV1/FVC (%) 101.60±6.51 101.34±6.29 0.193 0.847 PEF (%) 103.72±15.69 98.35±12.35 1.870 0.065 MEF75 (%) 99.86±20.06 96.34±15.78 0.961 0.339 MEF50 (%) 87.79±19.93 84.29±17.73 0.911 0.364 MEF25 (%) 76.88±21.71 72.75±19.93 0.973 0.333 MMEF 86.31±24.18 84.00±18.51 0.528 0.599

表 3 BPT基础肺功能比较 Tab.3 Comparison of basic pulmonary function following BPT (Mean±SD)

表 4(Tab.4)

表 4 BPT阳性率比较 Tab.4 Comparison of BPT positive rates n% (n/n) Group Asthma Reexamination of acute bronchitis χ2 P LTD4 26.1% (12/46) 3.1% (1/32) 7.164 0.007 MCH 72.5% (29/40) 15.2% (5/33) 23.900 0.000 χ2 18.476 2.804 P 0.000 0.094

表 4 BPT阳性率比较 Tab.4 Comparison of BPT positive rates n% (n/n)

与MCH组比较，LTD4组敏感性较低，特异度稍高，检测的准确度较低；LTD4组的ROC曲线下面积（AUC）低于MCH组（表 5、6、图 2）。

表 5(Tab.5)

表 5 LTD4-BPT与MCH-BPT的诊断学指标比较 Tab.5 Comparison of diagnostic indexes between LTD4-BPT and MCH-BPT Group Sensitivity Specificity Accuracy LTD4 0.2609 0.9688 0.2297 MCH 0.7250 0.8485 0.5735

表 5 LTD4-BPT与MCH-BPT的诊断学指标比较 Tab.5 Comparison of diagnostic indexes between LTD4-BPT and MCH-BPT

表 6(Tab.6)

表 6 LTD4-BPT与MCH-BPT的诊断价值 Tab.6 Diagnostic value of LTD4-BPT and MCH-BPT Group AUC Standard error 95% confidence interval P Upper limit Lower limit LTD4 0.635 0.065 0.508 0.761 0.049 MCH 0.787 0.055 0.678 0.895 0.000

表 6 LTD4-BPT与MCH-BPT的诊断价值 Tab.6 Diagnostic value of LTD4-BPT and MCH-BPT

图 2(Fig.2)

图 2 LTD4-BPT与MCH-BPT的ROC曲线分析 Fig.2 ROC curve analysis of LTD4-BPT and MCH-BPT.

LTD4-BPT结果为阴性的哮喘患儿共34例，均行MCH-BPT，其中20例（58.8%）哮喘患儿MCH-BPT检测结果为阳性，BPT分度为4例中度、7例轻度、9例极轻度。

LTD4组哮喘患儿不良反应按比例排列依此为：咳嗽、气促、胸部紧缩感及喘息；MCH组哮喘患儿的各种不良反应比例均高于LTD4组，且有统计学意义。两组患儿试验过程中均未出现呼吸困难等严重不良反应（表 7）。两组哮喘患儿的主要不良反应均可在雾化吸入0.25%特布他林溶液2 mL后平均10 min内缓解，恢复时间与FEV1下降率无相关性。

表 7(Tab.7)

表 7 BPT过程中哮喘患儿主要不良反应比较 Tab.7 Comparison of main adverse reactions in children with asthma during BPT [% (n)] Group Number Shortness of breath of breath Chest tightness Wheezing Cough LTD4 46 19.6% (9) 15.2% (7) 10.9% (2) 34.8% (16) MCH 40 52.5% (21) 42.5% (17) 35.0% (14) 77.5% (31) χ2 10.217 7.916 13.275 15.753 P 0.001 0.005 0.000 0.000

表 7 BPT过程中哮喘患儿主要不良反应比较 Tab.7 Comparison of main adverse reactions in children with asthma during BPT [% (n)]

AHR是一种病理生理状态，其影响因素很多，气道神经受体、气道慢性炎症、气道平滑肌力学的改变及气道重塑等均与其密切相关^[12-14]，其中，气道炎症被认为是导致气道高反应的重要发生机制。BPT是临床上常用的检测AHR的检测方式，根据激发剂对支气管的作用原理不同，分为直接和间接BPT。MCH、LTD4虽均为直接激发剂，但其具体的作用方式略有不同，MCH为胆碱能药物，吸入后直接与平滑肌细胞上的乙酰胆碱受体结合使平滑肌收缩；LTD4主要通过与Cys-LT1受体结合，除引起气道平滑肌收缩，还有促进黏液分泌、收缩血管、增加血管通透性的作用^[15-16]，其效价比MCH高、作用更持久，且其在哮喘炎症发展中的介导作用亦是MCH不具备的^[17-20]。那么，以LTD4作为激发剂的BPT在儿童临床应用中的表现究竟如何呢？研究中选取急支复查患儿作为正常对照，结果显示LTD4组哮喘患儿阳性率（26.1%）明显低于MCH组（72.5%），LTD4组敏感性（0.2609）明显低于MCH组（0.7250）；LTD4组及MCH组哮喘患儿与急支复查患儿阳性率比较，差异均有统计学意义，LTD4组急支复查患儿阳性率（3.1%）与MCH组（15.2%）比较无统计学差异，两种BPT特异性相似（LTD4组：0.9688；MCH组：0.8485），说明LTD4- BPT与MCH-BPT对疾病的诊断均有较高且相似的特异性，但由于LTD4-BPT敏感性太低，其临床应用中的诊断价值有限（准确性：0.2297；AUC：0.635）。本研究中，LTD4组哮喘患儿阳性率（26.1%）明显低于文献报道的成人哮喘患者LTD4-BPT的阳性率（87.1%）^[7-8]，说明儿童对LTD4的气道敏感性明显低于成人，分析原因是否与儿童肺组织内CysLTR受体表达较低有关，其有待进一步研究、证实。LTD4-BPT阴性的哮喘患儿再次行MCH-BPT，结果MCH-BPT的阳性率为58.8%，但分度以轻度、极轻度为主，表明LTD4-BPT阴性的哮喘患儿大多数仍有轻微的AHR，再次说明LTD4-BPT的敏感性显著低于MCH-BPT。综上分析，LTD4-BPT与MCH-BPT，特异性相似，但LTD4-BPT敏感性太低，大大限制了其在儿童气道高反应性检测中的应用。

目前国内外还没有标准化的白三烯激发试验的方法，且在儿童领域的研究也甚少。本研究参考广州呼吸病研究所的LTD4-BPT的方法进行试验^[7]，考虑儿童气道反应性较成人高的生理特点^[21]，且国外文献LTD4-BPT激发剂终止浓度范围为0.01~4.20 mmol/L^[22]，因此，本研究中LTD4-BPT激发剂的终止浓度采用成人LTD4-BPT的次极量，即1.200 μg（2.4 mmol/L），保证试验的安全性。BPT过程中主要不良反应与BPT阳性反应引起的患儿气道气流受限有关^[23-24]，本研究中急支复查患儿LTD4- BPT阳性率极低，因此，主要展示哮喘患儿LTD4-BPT过程中的主要不良反应，其主要不良反应为咳嗽（34.8%）、气促（19.6%）、胸部紧缩感（15.2%）以及喘息（10.9%），其不良反应的发生率较文献报道的成人低^[7]，可能与本实验设计的终止浓度、研究对象（哮喘缓解期患儿）^[8]、儿童LTD4-BPT阳性率较低及儿童生理^[25]等有关。LTD4- BPT的不良反应发生率明显低于MCH-BPT，可能与LTD4-BPT阳性率较低有关，两种BPT中均未发生严重不良反应，主要不良反应均可在雾化吸入支气管舒张剂后缓解，说明LTD4及MCH作为激发剂具有较高的安全性。

遗憾的是，LTD4-BPT耗时且研究成本较高，因此纳入的样本量较少，未能摸索出适合儿童的LTD4-BPT的阳性阈值，激发剂的终止浓度采用的成人LTD4-BPT的次极量，可能影响了LTD4在本研究中的应用价值。

综上所述，LTD4-BPT在儿童临床应用中安全性高，与MCH-BPT特异性相似，但敏感性较低，诊断学价值较低，在儿童气道高反应性检测中的应用价值有限。