2020, Vol. 40
肝癌是一种发生在肝脏的恶性肿瘤，死亡率位居恶性肿瘤第3位，预后差，患者生存率较低，严重危害患者身心健康[1-6]。miR-144是定位于人染色体17q11.2的微小RNA，在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，miR-144在肝癌癌组织中表达显著下调，和肝癌细胞生物学功能密切相关，在其临床治疗中具有重要意义[7-9]。TLR/MyD88信号通路广泛存在各种组织细胞中，可调控机体免疫炎症、细胞生长、肝纤维化等多种生理病理过程，且在乳腺癌、结肠癌的产生及发展中发挥着重要的调控作用[10-12]，另外研究显示，miR-144可负性调控TLR表达[13]，但miR-144是否可介导TLR/MyD88信号传导，进而调控肝癌细胞增殖及侵袭目前还不清楚，因此本研究探讨miR-144过表达对SMMC-7721细胞生物学行为的影响及其可能作用机制。
1 材料和方法 1.1 实验材料人正常细胞系HL-7702、肝癌细胞系SMMC-7721（增普赛，批号：CL-0111、CM-0227）；10%胎牛血清、胰酶、RPMI 1640培养基（源叶生物，批号：S0604、S1713、S66457）；CCK8相关试剂（碧云天，批号：C0041）；Trizol蛋白提取试剂盒、Bio Rad逆转录试剂盒、BCA试剂盒（Invitrogen，批号：R0024L、R0118FT、M4017K）；鼠抗人金属基质蛋白酶2（MMP-2）、金属基质蛋白酶9（MMP-9）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）、核因子-κB（NF-κB）、GAPDH一抗及二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗鼠免疫球蛋白）、MyD88抑制剂TJ-M2010-2（香港基因有限公司，批号：SD7176-10、SF4153-10、ST1473、ML1819、SC0146-13、C0712-4、AF0043、H-GR0011、H-J3317）；Transwell相关试剂（BD，批号：SF5337-10）；ECL化学发光剂试剂盒（生工生物，批号：AS00337）；ABI 7500型实时荧光定量PCR仪（ABI）；BioPhotometer plus型核酸蛋白测定仪（Eppendorf）；Gel DocXR型凝胶成像仪（Bio-Rad）；160A-IR型CO2培养箱（丙林电子）。其余试剂购自国药集团，均为分析纯。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人正常细胞系HL-7702，肝癌细胞系SMMC-7721经常规复苏后，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、饱和湿度、5%CO2条件无菌恒温培养箱内培养。根据细胞生长情况定期换液与传代，3代后进行计数，进行细胞接种。
1.2.2 细胞转染及转染效率检测选取1.2.1中对数生长期的SMMC-7721细胞，按照2×105/孔密度接种于24孔培养板中，待细胞密度达50%~70%时，更换为不含胎牛血清的RPMI 1640培养基，分别加入miR-144 NC（miR-144 NC组）和miR-144 mimics（miR-144 mimics组）进行转染（浓度参照文献[14]及Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书），加入事先装有l00 μL Opti-Medium的RNAasefree离心管中，然后加入Lipofectamin 2000试剂4 μL，将质粒与对应脂质体溶液混合，静置20 min，加入培养孔，另取装有Opti-Medium l00 μL的RNAasefree离心管作为空白组。转染48 h后，取出盖玻片盖在载玻片上，使用荧光显微镜观察技术表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场中观察技术统一视野中的总细胞数，计算转染效率，转染效率=荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%。
1.2.3 细胞分组（1）正常组与肝癌SMMC-7721细胞组miR-144表达情况。分为2组，每组细胞均设6个复孔：①正常组：HL-7702细胞，继续培养48 h；②SMMC-7721组：SMMC-7721细胞，继续培养48 h。提取总RNA；（2）miR-144过表达对SMMC-7721细胞存活率、侵袭能力影响。将SMMC-7721细胞随机分为3组，每组细胞均设6个复孔，分别为空白组、miR-144 NC组、miR-144 mimics组，提取各组细胞总蛋白；（3）miR-144过表达对TLR/MyD88通路相关蛋白表达情况。细胞分为4组，每组细胞均设6个复孔，分别为空白组、miR-144 NC组、miR-144 mimics组、TJ-M2010-2组（加入40 μmol/L的TJ-M2010-2预处理1 h）。提取各组细胞总蛋白。
1.2.4 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测miR-144表达分别按照1.2.3中（1）（2）分组情况，通过Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，应用Bio Rad逆转录试剂盒将1 μg RNA逆转录为cDNA，反转录体系为10 μL（2 μL 5× Reaction mix，1μL Random primer，0.5 μL逆转录酶，5μL RNA样品），25 ℃ 5min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min灭活逆转录酶活性，用去离子水将cDNA稀释10倍后-20 ℃保存。采用2×SYBR Green PCR MAsterMix，以cDNA为模板，进行qRT-PCR检测，95 ℃预热3 min，（95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s）×35次，72 ℃ 5 min终止反应。miR-144以U6为内参，引物设计见表 1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
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表 1 qRT-PCR引物序列 Tab.1 Primer sequence of qRT PCR |
按照1.2.3中（2）分组情况，分别培养24、48、72、96 h，每组设6个复孔，加入10 μL CCK-8溶液，培养4 h后用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度A，以未接种细胞质加培养基孔的A为空白对照调零，并计算细胞存活率。细胞存活率=[（A处理组-A空白组）（/A未处理组-A空白组] ×100%。
1.2.6 细胞侵袭试验按照1.2.3中（2）分组情况，计数后于无血清的DMEM培养液中重悬。上室每孔加入细胞悬液100 μL，下室加入500 μL含10%FBS的完全培养基，缓慢加入，以防加入过程中产生大气泡。37 ℃孵育24 h。取出小室，用PBS轻洗两遍，用棉签去除滤膜上室面的细胞和Matrigel胶，将细胞与1%多聚甲醛混合固定后加入Giemsa染色30 min，用倒置显微镜随机选取5个视野并拍照，计算穿模细胞数，实验重复3次，取平均值表示细胞的侵袭能力。
1.2.7 Western blot法检测相关蛋白表达分别按照1.2.3中（2）（3）分组情况，提取总蛋白，通过BCA蛋白试剂盒检测细胞中总蛋白含量，10% SDS-PAGE分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。封闭完成后加入适宜浓度MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB鼠源一抗，4 ℃封闭过夜，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜后，加入相应二抗（山羊抗鼠）37 ℃封闭1 h，滴加ECL显色液，用凝胶成像系统获取蛋白条带图片，用Tanon 600图像分析系统拍照对蛋白质表达量进行定量分析，以GAPDH为内参。
1.3 统计学方法采用统计学软件SPSS 17.0进行数据分析，计量资料均以均数±标准差表示，多组间比较行方差分析，两组间比较采用Snk-q检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 正常组与肝癌SMMC-7721细胞组miR-144表达比较与正常组相比，SMMC-7721组miR-144基因相对表达量显著降低（P < 0.05，表 2）。
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表 2 正常组与肝癌SMMC-7721细胞组miR-144基因表达比较 Tab.2 Comparison of mir-144 gene expression between normal group and SMMC-7721 cell group (Mean±SD) |
荧光显微下miR-144 NC组、miR-144 mimics组细胞转染效率均达90%以上（图 1）。与空白组相比，miR-144 NC组miR-144基因表达差异不显著（P > 0.05），miR-144 mimics组miR-144基因表达显著升高（P < 0.05）；与miR-144 NC组相比，miR-144 mimics组miR-144基因表达显著升高（P < 0.05，表 3）。
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图 1 miR-144过表达模型的建立 Fig.1 Overexpression of miR-144 in the cells (Original magnification: ×200). A: mir-144 NC group; B: mir-144 mimics group. |
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表 3 3组miR-144表达情况比较 Tab.3 Comparison of expression of mir- 144 in three groups (Mean±SD) |
CCK-8实验显示，与空白组相比，miR-144 NC组各时间点细胞存活率差异无统计学意义（P > 0.05），miR-144 mimics组转染48、72、96 h后细胞存活率显著降低（P < 0.05）；与miR-144 NC组相比，miR-144 mimics组转染48、72、96 h后细胞存活率显著降低（P < 0.05，表 4）。
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表 4 miR-144过表达对SMMC-7721细胞存活率的影响 Tab.4 Effect of over expression of miR-144 on survival rate of SMMC-7721 cells (n=6, Mean±SD, %) |
Transwell试验显示，与空白组相比，miR-144 NC组侵袭细胞数差异无统计学意义（P > 0.05），miR-144 mimics组侵袭细胞数显著降低（P < 0.05）；与miR-144 NC组相比，miR-144 mimics组侵袭细胞数显著降低（P < 0.05，图 2、3）。
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图 2 Transwell实验检测SMMC-7721细胞侵袭能力的变化 Fig.2 Change of invasion ability of SMMC-7721 cells detected by Transwell assay (×200). A: blank group; B: mir-144 NC group; C: mir-144 mimics group. |
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图 3 三组MMP-2、MMP-9蛋白表达情况 Fig.3 Expression of MMP-2 and MMP- 9 in the 3 groups. A: Western blotting to detect the expression of MMP-2 and MMP- 9 in three groups (×200). a: blank group, b: mir-144 NC group, c: mir-144 mimics group; B: Number of invasive cells (left), expression of MMP-2 and MMP-9 (right) in three groups. aP < 0.05 vs blank group; bP < 0.05 vs mir- 144 NC group. |
与空白组相比，miR-144 NC组MMP-2、MMP-9蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），miR-144 mimics组MMP-2、MMP-9蛋白表达降低（P < 0.05）；与miR-144 NC组相比，miR-144 mimics组MMP-2、MMP-9蛋白表达降低（P < 0.05，图 3）。
2.5 miR-144过表达对TLR/MyD88免疫通路相关蛋白影响与空白组相比，miR-144 NC组TLR4、MyD88、pNF-κB/NF-κB蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），miR-144 mimics组TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达显著降低（P < 0.05）；与miR-144 NC组相比，miR-144 mimics组、TJ-M2010-2组TLR4、MyD88、pNF-κB/NF-κB蛋白表达显著降低（P < 0.05）；与miR-144 mimics组相比，TJ-M2010-2组TLR4、MyD88、p-NF- κB/NF-κB表达差异无统计学意义（P>0.05，图 4）。
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图 4 TLR4/MyD88通路相关蛋白表达情况 Fig.4 TLR4 / MyD88 pathway related protein expression. A: Western blotting. a:blank group, b: mir-144 NC group, c: mir-144 mimics group; d: TJ-M2010-2 group; B: B Bar chart. aP < 0.05 vs blank group; bP < 0.05 vs mir-144 NC group. |
肝癌早期通常无症状，但有治愈可能，中晚期治疗复杂，且临床研究表明超50%患者肝癌根治术后存在转移及复发危险，因此研究肝癌发生、发展相关基因及其机制对于肝癌的诊治具有重要意义[15-17]。miR-144在多种恶性肿瘤中低表达，并具有抑癌作用[18-21]，肝癌患者癌组织中miR-144表达显著下调，过表达的miR-144可靶向CCNB1抑制肝癌细胞SMMC-7721、QGY-7703的增殖、侵袭迁移过程，且miR-144表达水平与其临床病理特征及预后密切相关[22-25]。本研究结果显示，SMMC-7721细胞miR-144基因表达显著低于HL-7702细胞，以miR-144 mimics转染SMMC-7721细胞后，于倒置荧光显微镜镜下观察显示miR-144 NC及转染进入细胞内的效率高达90%，qRT-PCR检测发现miR-144 mimics组miR-144基因表达水平显著高于阴性对照组与对照组，提示转染成功可供后续使用。另外本研究发现miR-144过表达可显著降低SMMC-7721细胞存活率及细胞侵袭数目，并明显下调侵袭迁移相关蛋白MMP- 2、MMP-9表达，表明miR-144参与介导肝癌细胞SMMC-7721的增殖及侵袭过程，上调其表达水平可抑制细胞增殖，降低其侵袭能力，提示miR-144可对肝癌发挥抑癌作用，与前人研究结果相类似，但具体机制目前还不了解。
TLR作为一种跨膜蛋白，是一种重要的模式识别受体，可识别多种病原相关分子结构，引起机体免疫应答，可破坏机体稳态，诱导炎性反应，此时微环境中产生的大量细胞因子与趋化因子，在恶性肿瘤的发生发展中具有重要的调控作用，并可促进肿瘤血管生成、抑制抗肿瘤免疫，进一步加速恶性肿瘤发展[26-29]。MyD88是几乎所有TLR亚型分子的下游转导因子，可通过调控NF-κB信号传导而启动炎性细胞因子表达，导致炎性介质过度释放，从而对机体造成炎性损伤[30-31]，TLR分子可通过调控MyD88表达在结直肠癌的发生发展过程中发挥重要作用[32]，另外微小RNA miR-30、miR-23a-5p、miR-146a可通过调控TLR/MyD88信号表达影响机体免疫炎症反应及自噬过程[33-35]，且miR-144与TLR4之间存在结合位点[36]，据此可猜测miR-144可能通过TLR/MyD88信号通路在肝癌细胞增殖及侵袭过程中发挥调控作用。本研究结果显示，过表达miR-144后，TLR4、MyD88蛋白以及NF-κB磷酸化水平较miR-144 NC组及正常组低，而miR-144 mimics组与MyD88抑制剂TJ-M2010-2组TLR4、MyD88蛋白以及NF-κB磷酸化水平一致，表明miR-144可调控MyD88表达，过表达miR-144可抑制TLR/MyD88通路转导及NF-κB激活，降低SMMC-7721细胞存活、抑制SMMC-7721细胞侵袭作用。
综上所述，miR-144在肝癌SMMC-7721细胞中低表达，miR-144过表达可能通过抑制TLR/MyD88通路激活发挥抑制SMMC-7721细胞存活、侵袭作用，为肝癌的治疗提供了潜在靶基因。但本研究也存在一定不足，肝癌是多基因、多通路影响的复杂过程，miR-144参与肝癌SMMC-7721细胞生物学特征的具体机制有待进一步探索。
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