乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。全球每年新发病例可达170万以上，并以每年3%~4%的速度递增^[1-2]。其发病率在我国虽低于欧美水平，而地域差异明显，发病年龄逐渐年轻化^[3]。因此，开展乳腺癌的研究具有重要的现实意义。近年来，抑癌基因的甲基化失活对乳腺癌的影响日益受到关注^[4]。OPCML是广泛的存在于正常组织的一类免疫球蛋白超家族，其功能主要是参与细胞之间的识别与黏附，也可以激活相关的转导通路，发挥抑癌基因的作用^[5-6]。研究发现，在人的乳腺癌细胞中OPCML呈低水平表达或缺失，且其表达水平与OPCML基因启动子的甲基化状态密切相关^[7]，用甲基转移酶抑制剂处理使其去甲基化后可恢复其表达及原有功能^[8]。表明抑癌基因的去甲基化是防治肿瘤的重要策略^[9]。木犀草素是一类天然的黄酮类化合物，药理学研究表明，其不仅能抑制肿瘤细胞增殖，还具有抗氧化、抗炎症等多重功效^[10-11]，还可通过多种机制抑制肿瘤细胞生长^[12]，但迄今为止有关OPCML在乳腺癌癌中的作用仍不明确。因此本研究旨在研究OPCML对MDA-MB-231乳腺癌细胞生长增殖中的影响，并初步探讨其机制。

乳腺癌细胞株MDA-MB-231（中科院细胞库）；木犀草素（Sigma-Adrich）；MTT试剂（北京索莱宝科技有限公司）；Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒（北京碧云天公司）；鼠抗人OPCML、DNMT1以及GAPDH抗体（Santa Cruz）；DMNT甲基化试剂盒（Epigentek）。RPMI 1640、胎牛血清等细胞培养试剂（上海生物工程股份有限公司）。

MDA-MB-231细胞均培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，且在培养基中加入1%的青霉素-链霉素。加入培养基后细胞于37 ℃、5% CO₂条件下培养。当细胞密度达到80%左右时，更换新的RPMI 1640培养基。随后用5、10以及20 μmol/L的木犀草素处理细胞24 h。

待MDA-MB-231细胞生长至80%左右时，以3× 10⁴/mL的细胞密度加入至96孔板中，每孔150 μL。在各个细胞孔中加入不同浓度的木犀草素，每组均设3个复孔，并在细胞培养箱中继续培养24 h。随后在各孔中分别加入15 μL的MTT试剂，继续培养4 h后加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。最后于酶标仪上测定各孔的吸光度值（A_{490 nm}），并计算细胞活性。

收集处理后的MDA-MB-231细胞。用含1%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗固定细胞，并于1000 r/min条件下离心10 min。随后用100 μL Binding缓冲液重悬细胞，并充分振荡混匀。混匀后加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI溶液，37 ℃避光反应15 min后加入50 μg/mL的碘化丙啶进行染色。最后于流式细胞仪上进行检测。

建立甲基化特异性PCR（MSP）的反应体系10 μL，其中含有5 μL PCR Mix、2 μL引物（2 μmol/L）、2 μL DNA（2 μg）、1 μL ddH₂O。MSP反应条件：95 ℃下预变性10 min，随后进入40个以下循环：95 ℃变性30 s，56 ℃下退火22 s，在58 ℃ 32 s，然后72 ℃延伸30 s。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，用凝胶记录拍照（Bio-Rad）。

使用Epigentek提供的试剂盒从MDA-MB-231细胞提取总蛋白，并采用Bradford法测定蛋白浓度后将其储存于-80 ℃备用。使用Epiquik DNMT活性分析试剂盒测定细胞内DNMT1的活性（Epigentek），即，将10 μg总蛋白添加到包被有富含胞嘧啶DNA的样品孔中，根据试剂盒的说明依次加入捕获抗体与显色剂，最后使用酶标仪（Thermo-Scientific）获取A_{490 nm}值，结果以相对活性表示（相对活性=处理组活性/对照组活性×100%）。

收集上述处理后的细胞提取细胞总蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度。在蛋白样本中加入上样缓冲液后进行SDS-PAGE电泳。随后进行转膜，并将膜于5%脱脂奶粉中封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜后再加二抗室温孵育2 h。最后在膜上滴加ECL发光液后置于显影仪中避光显影。

获取对数生长期的MDA-MB-231细胞，在每只裸鼠右腋皮下接种0.2 mL细胞悬液（细胞量约5×10⁶），接种后置于SPF环境饲养。每2~3 d测量皮下肿瘤直径，待肿瘤直径为0.5~0.6 cm时，按每克体质量每2 d灌胃给予10、20和30 mg/kg木犀草素，共7次。灌胃后的小鼠自由进食、饮水。最后1次灌胃20 d后处死小鼠，获取瘤组织用于Western blot分析。

采用转染试剂将构建好的PL- Sp1质粒转染至MDA-MB-231细胞中，并以空白PL质粒作为对照。转染结束后加入木犀草素处理48 h，随后在上述细胞中加入裂解液，获取总蛋白用于Western blot分析。

使用graphpad prism 6.0软件进行统计分析。单因素方差分析和t检验用于多重比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。

MTT结果显示，MDA-MB-231细胞经5、10、20 μmol/L木犀草素孵育72 h后，随着浓度的递增，细胞活性分别降至对照组的（93±2.5）%、（76±3.4）%和（54±6.2）%（P < 0.05，图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 不同浓度木犀草素对MDA-MB-231细胞增殖的影响 Fig.1 Effects of different concentrations of luteolin on the proliferation of MDA-MB-231 cells. *P < 0.05vs control group (0 μmol/L).

流式细胞术结果也显示，未处理组细胞凋亡率为2.67%，5、10、20 μmol/L木犀草素处理后，凋亡率分别为8.34%，14.46%和22.07%，与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05，图 2）。

图 2(Fig.2)

图 2 不同浓度木犀草素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 Fig.2 Effects of different concentrations of luteolin on apoptosis of MDA-MB-231 cells.

实时定量PCR结果显示，OPCML mRNA在对照组中表达水平很低，给予木犀草素处理24 h后，随着其剂量的增加，细胞内OPCML的mRNA水平逐渐增多，其中20 μmol/L木犀草素处理后，mRNA相对表达量的水平是对照组的2.33倍（P < 0.05，图 3A）。OPCML蛋白表达变化趋势与mRNA一致（图 3B）。

图 3(Fig.3)

图 3 木犀草素上调MDA-MB-231细胞OPCML mRNA和蛋白表达 Fig.3 Luteolin upregulates OPCML mRNA and protein expressions in MDA-MB-231 cells, *P < 0.05vs control group (0 μmol/L); A: Fold change of expression of OPCML mRNA; B: Expressions of OPCML proteins after luteolin treatment.

不同浓度木犀草素处理后，能有效降低甲基化OPCML（M）水平，而非甲基化OPCML（U）逐渐增多（图 4）。

图 4(Fig.4)

图 4 木犀草素对OPCML启动子甲基化的影响 Fig.4 Effect of luteolin on methylation of OPCML promoter.

不同浓度木犀草素处理后，胞内甲基化酶的活性均有所降低。其中5、10、20 μmol/L木犀草素处理后，甲基化酶活性与对照组相比分别降低了16%、28%和37%（图 5A）。此外，Western blot结果也显示，采用不同浓度木犀草素处理后，细胞内甲基化转移酶DNMT1的表达水平也明显降低（图 5B）。

图 5(Fig.5)

图 5 不同浓度木犀草素对胞内甲基化的影响 Fig.5 Effects different concentrations of luteolin on the intracellular methylation of the cells. A: Activity of methylation after luteolin treatment. *P < 0.05vs control group (0 μmol/L); B: Changes in expression of DNMT1 protein in luteolin-treated cells.

木犀草素处理后，细胞中Sp1的活性显著降低（图 6A）。此外，通过MDA-MB-231细胞建立的小鼠异种移植瘤组织中Sp1活性也随木犀草素浓度增加而降低（图 6B）。

图 6(Fig.6)

图 6 木犀草素对体内外Sp1活性的影响 Fig.6 Effect of luteolin on Sp1 activity in vitro and in vivo. A: Sp1 activity in MDA-MB-231 cells; B: Sp1 activity in xenografted tumors after luteolin treatment. *P < 0.05 vs control group.

将MDA-MB-231细胞转染PL-Sp1载体使其胞内过表达Sp1（图 7A），随后用20 μmol /L木犀草素处理72 h后，Western blot结果显示，OPCML蛋白表达水平明显降低（图 7B），MDA-MB-231细胞增殖水平也明显削弱（图 7C）。

图 7(Fig.7)

图 7 过表达Sp1对OPCML表达及细胞活性的影响 Fig.7 Effect of over-expression of Sp1 on OPCML expression and cell viability. A: Over-expression of Sp1 in MDA-MB-231 cells. B: Effect of Sp1 over-expression on luteolin-induced OPCML expression; C: Effect of Sp1 over-expression on luteolin-induced inhibition of cell viability.*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs PL vector group.

木犀草素本名为3'，4'，5，7-四羟基黄酮，含有C6-C3-C6、苯环，有含氧碳环及C2-C3碳双键。是其发挥生物学作用的重要结构^[13-15]。研究表明，木犀草素对结直肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞以及肝癌细胞的生长增殖具有抑制作用，并能影响细胞内与生长增殖相关的多条信号通路的激活^[16-18]。在本研究结果证实木犀草素能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，且随着浓度增大、培养时间延长，对细胞抑制效果越明显^[5]，同时也发现木犀草素能诱导MDA-MB-231细胞凋亡。由于原癌基因、抑癌基因的异常均参与了乳腺癌的发生和发展过程^[19]，因此我们对木犀草素能否影响抑癌基因的表达进行了研究。OPCML是持细胞正常功能、分化发育，改变细胞表达的重要基因，在多种肿瘤细胞中，OPCML表达往往异常，包括卵巢癌、膀胱癌、肺癌和胃癌等^{[7, 20-21]}。2003年，Sellar首次于卵巢癌的细胞株A2780及正常卵巢的上皮细胞中发现OPCML基因的表达水平异常，主要表现为表达水平下调、细胞出现失控性生长^[22]；而正常机体内，OPCML基因呈一定水平表达，并参与增加细胞间的识别及粘附，并对肿瘤的发生具有抑制作用^[23]，进一步研究表明，OPCML基因在多种呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤中均表达缺失^[24-26]，OPCML缺失后细胞可出现失控性生长，通过基因手段上调其表达后可以增加细胞间的识别及粘附能力，并能抑制细胞的增殖^{[8, 27]}。本研究用不同浓度木犀草素培养MDA-MB-231细胞72 h，以实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中OPCML mRNA和蛋白表达水平的影响。结果发现，OPCML在MDA-MB-231乳腺癌细胞中呈现低表达状态，不同浓度的木犀草素可以剂量依赖性的方式增加OPCML基因mRNA及蛋白的表达水平。表明木犀草素能通过某种机制上调OPCML重新表达，从而减弱乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学活性。研究表明，抑癌基因的甲基化是其失活的重要机制^[28-29]。为了分析MDA-MB-231细胞在木犀草素处理后对OPCML表达水平上调是否与OPCML启动子区域的甲基化水平相关，我们采用MSP方法对不同浓度木犀草素处理后的MDA-MB-231细胞启动子区域甲基化水平进行了检测^[30]，结果证实，木犀草素可有效降低OPCML启动子区域甲基化水平。此外，酶活性实验结果也证实20 μmol/L木犀草素处理组与未处理组相比，细胞内甲基化活性也明显降低），并与DNMT1蛋白的表达水平成一定的正相关。结合以上结果均表明木犀草素可影响MDA-MB-231细胞内的甲基化活性，进而更一步的激活OPCML抑癌基因表达。

为了进一步明确木犀草素的作用机制，本研究随后探讨了核转录因子Sp1在木犀草素影响MDA-MB-231细胞增殖中的作用。首先，我们检测了木犀草素处理前后Sp1活性的变化，结果发现5、10、20 μmol/L木犀草素处理后Sp1与DNA的结合活性显著降低，动物实验中也得到了类似的结果。由于Sp1是引起抑癌基因甲基化的重要核转录因子，随后我们反向验证了Sp1对木犀草素抑制MDA-MB-231细胞增殖以及OPCML表达的影响。通过细胞内过表达Sp1后，Sp1对MDA-MB-231细胞增殖的抑制效应以及OPCML的表达明显削弱，表明木犀草素最终是影响Sp1的活性而上调OPCML的表达，最终影响细胞的增殖。

综上所述，木犀草素可以诱导乳腺癌细胞的生长抑制，并降低OPCML基因的甲基化水平，进而上调其表达水平密切相关。功能在一定程度上和5-Aza-CdR类似，而木犀草素是一种多甲氧基黄酮，由于其来源于自然界，其毒性相对较低，因此是一种潜在的安全的肿瘤辅助用药。