2020, Vol. 40
肠出血性大肠杆菌血清型O157 : H7（EHEC）是一种高度传染性的食源性病原体，引起严重的胃肠道疾病[1]。EHEC感染主要表现为出血性结肠炎，更为严重的是危及生命的溶血性尿毒综合征，对人类健康造成潜在的严重威胁[2-4]。据报道，EHEC感染的易感性因人而异，婴儿、儿童和老年人易感，特别是年龄小于5岁的患者发生严重症状的风险很高[5]。有研究报道了首例18岁男性感染EHEC引起肠套叠的病例[6]。目前对EHEC感染缺乏有效的治疗方案，抗生素治疗并没有改善EHEC引起的肠炎病程，甚至会增加并发溶血性尿毒综合征的危险[7-8]。因此，目前亟需转变策略，发展以预防为主的防控手段，以减少EHEC感染带来的疾病负担和经济负担。
研究认为益生菌可通过维持肠道微生态平衡、提高肠道免疫力等途径增强肠道屏障功能，在保持机体健康、预防及治疗肠道相关疾病中应用广泛[9-14]。目前使用较广泛的益生菌主要包括各种乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌等。有研究用双歧杆菌乳杆菌三联活菌片成功预防了大肠杆菌K1株感染[15]；有研究用嗜酸乳杆菌成功抑制了EHEC肠道定植[16]。但是益生菌的安全性存疑：在临床应用过程中发现，对于一些早产儿、极度虚弱或免疫缺陷的病人使用益生菌可能引起患者全身性感染、脓毒症、乳酸中毒、胃肠道不良反应等症状[17-19]。
鼠李糖乳杆菌GG株（LGG）活菌本身及其代谢物都是目前研究得最为深入的益生菌。我们的前期研究表明LGG培养上清液（LCS）可促进新生大鼠肠道屏障功能的发育和完善，并增强其对大肠杆菌K1株感染的抵抗力[20]。利用高效液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/ MS）技术，我们鉴定出LCS中潜在的生物活性蛋白（命名为HM0539），并发现其对肠屏障功能有益[21]。但是HM0539是否对EHEC的感染具有预防及治疗作用还未可知。本研究主要通过体内、外实验考察HM0539防治EHEC感染的效果，并探讨在此过程中HM0539对EHEC感染肠道上皮屏障功能的影响及其潜在机制。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级3周龄雌性BALB/c小鼠，由南方医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 菌株和细胞EHEC标准株EDL933（链霉素抗性）、HT-29细胞，本实验室保存。
1.1.3 主要试剂和仪器胰蛋白胨、酵母提取物、PAS试剂盒（北京Solarbio），1640细胞培养基（美国Gibco），FBS（PA），蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技有限公司），MUC2抗体（武汉Proteintech Group），ZO-1抗体、Occludin抗体（武汉Servicebio），辣根过氧化物酶标记的二抗（北京鼎国生物科技有限公司）。荧光显微镜（日本Nikon），SDS-PAGE凝胶电泳仪、电转仪（美国Bio-Rad）。
1.2 方法 1.2.1 EHEC菌液的制备EHEC培养于LB液体培养基[16]。收集对数生长期细菌，PBS洗3次，重悬于无菌PBS中，分光光度计调整好菌液浓度，置于4 ℃备用。
1.2.2 HM0539的表达、纯化和脱盐HM0539的表达和纯化参考文献[21]所述。HM0539经超滤浓缩除盐后，加入终浓度为20%的甘油，BCA法测量蛋白浓度，-80 ℃保存备用。
1.2.3 负载HM0539玉米醇溶蛋白-果胶颗粒的制备采用玉米醇溶蛋白-果胶负载技术制备HM0539-果胶颗粒，该剂型能保护蛋白免受胃酸消化，缓慢释放于肠道发挥保护功效。果胶颗粒的制备方法参考文献[21]所述。
1.2.4 HM0539不同浓度实验分组将细胞培养于24孔板中，置于37 ℃，5%二氧化碳恒温箱中培养10 d；实验分3组，向各处理组中分别加入10 ng/mL和100 ng/mL终浓度的HM0539，对照组中加入等体积的PBS于培养箱中孵育4 h，每组设3个副孔，然后向每孔中加入1× 107 CFU EHEC处理4 h进行黏附侵袭实验。
1.2.5 HM0539不同处理方式实验分组细胞培养及分组同上，向预处理组中预先加入100 ng/mL终浓度的HM0539于培养箱中孵育4 h，同时处理组中同时加入100 ng/mL终浓度的HM0539和1×107 CFU EHEC，对照组中同时加入等体积的PBS和1×107 CFU EHEC，每组设3个副孔，处理4 h进行黏附侵袭实验。
1.2.6 黏附实验上述处理完后，弃去培养基，PBS洗3次，加入150 μL 0.5%TritonX-100裂解8 min；裂解完后迅速加入850 μL PBS终止裂解，用枪头反复吹打每孔使悬液混匀；吸取悬液进行倍比稀释，取50 μL液体涂布于含链霉素的LB平板，放入37 ℃培养箱中培养10 h进行菌落计数；EHEC相对黏附率=（处理组各组菌落数/对照组中菌落数的均数）×100%。
1.2.7 侵袭实验上述处理完后，弃去培养基，PBS洗3次，加入含100 μg/mL氨苄青霉素的全培处理1 h，杀死细胞外细菌；弃去培养基，PBS洗3次，加入150 μL 0.5% TritonX-100裂解8 min；裂解完后迅速加入850 μL PBS终止裂解，用枪头反复吹打每孔使悬液混匀；吸取悬液进行倍比稀释，取50 μL液体涂布于含链霉素的LB平板，放入37 ℃培养箱中培养10 h进行菌落计数；EHEC相对侵袭率=（处理组各组菌落数/对照组中菌落数的均数）×100%。
1.2.8 细胞免疫荧光实验检测MUC2、ZO-1和Occludin蛋白的表达细胞培养、分组及处理同上；细胞处理完后，弃去培养基，PBS浸洗3次；加入-20 ℃冰冻甲醇，室温固定30 min；PBS浸洗3次，封闭液处理30~45 min；弃去封闭液，加入稀释好的相应一抗4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBST浸洗3次，5 min/次；加入稀释好的二抗，避光孵育2 h；弃去二抗，PBST避光浸洗3次，10 min/次；加入40%甘油，荧光显微镜下观察结果。
1.2.9 Western blot检测MUC2、ZO-1和Occludin蛋白的表达细胞培养、分组及处理同上；弃去培养液，预冷PBS洗3次，提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，将电泳产物转印到PVDF膜，3% BSA室温封闭1 h，加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后用对应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，再次洗膜后用化学发光法显色，观察各组蛋白表达量。
1.2.10 动物实验将小鼠随机分成4组（攻毒前，NC组和EHEC组每天灌胃空白果胶，连续7 d；HM0539组和HM0539+EHEC组每天灌胃HM0539果胶，连续7 d），10只/组。攻毒前提前3 d用链霉素水喂食小鼠并禁食12 h，EHEC组和HM0539 + EHEC组用100 μL × 1011 CFU/mL EHEC菌液灌胃小鼠，同时腹腔注射丝裂霉素（2.5 mg/kg），间隔12 h后用同样的菌量再次灌胃小鼠。NC组和HM0539组用100 μL无菌PBS模拟攻毒。
1.2.11 空肠组织H & E染色，PAS染色，MUC2、ZO-1的免疫组化攻毒后观察小鼠的生长状态，记录小鼠的体质量及存活情况，观察7 d后，取小鼠空肠组织制H & E、PAS及免疫组化切片。
1.3 统计学分析所有实验至少重复3次，使用软件SPSS 20.0进行统计分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HM0539可以抑制EHEC对HT-29细胞的黏附侵袭HM0539可以降低EHEC对HT-29细胞的黏附率和侵袭率，且具有浓度依赖性（P < 0.01，图 1AB）。将浓度为100 ng/mL HM0539与1×107 CFU EHEC共同处理细胞，结果显示，虽然HM0539共同处理组有降低EHEC对HT-29细胞黏附侵袭率的趋势，但差异无统计学意义（P < 0.05，图 1C、D）。HM0539能够抑制EHEC对HT-29细胞的黏附侵袭，同时用HM0539预处理的效果明显优于HM0539与EHEC同时处理。接下来的实验都采用HM0539预处理。
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图 1 HM0539对EHEC黏附、侵袭HT-29细胞的影响 Fig.1 Effect of HM0539 on adhesion and invasion of EHEC to HT-29 cells. A: HM0539 significantly inhibits the adhesion of EHEC to HT-29 cells in a dose-dependent manner; B: HM0539 significantly inhibits the invasion of EHEC in HT-29 cells in a dose-dependent manner; C: The inhibitory effect of HM0539 on EHEC adhesion to HT-29 cells is stronger in HM0539 pretreatment group than in the co-treatment group; D: The inhibitory effect of HM0539 on EHEC invasion in HT-29 cells is stronger in HM0539 pretreatment group than in the co-treatment group. *P < 0.05; **P < 0.01. |
EHEC能够明显降解细胞分泌的MUC2蛋白，加入HM0539进行处理后，可以抑制EHEC对MUC2蛋白的破坏（P < 0.05，图 2A、B）；免疫荧光实验也显示EHEC单独处理组中绿色荧光明显更少，且分布很不均匀，HM0539与EHEC组中，绿色荧光明显增多（图 2C）。
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图 2 不同处理条件下细胞MUC2蛋白的表达变化 Fig.2 Expression of MUC2 in HT-29 cells with different treatment. A: Western blot analysis of MUC2; B: Image J semi-quantitative analysis of MUC2; C: Immunofluorescence analysis of MUC2. *P < 0.05 vs the control. |
EHEC能够明显降低细胞间紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表达量，加入HM0539处理后，ZO-1和occludin蛋白的表达量明显高于EHEC组（P < 0.05，图 3ABCD）；免疫荧光实验显示，EHEC单独处理组中绿色网格明显更少且不完整，HM0539+EHEC组中，绿色网格明显增多且基本完整（图 3E、F）。
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图 3 不同处理条件下细胞间紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达变化 Fig.3 Expression of tight junction proteins ZO-1 and occludin in HT-29 cells. A: Western blot analysis of ZO-1; B: Image J semi-quantitative analysis of ZO-1; C: Western blot analysis of occludin; D: Image J semi-quantitative analysis of Occludin; E: Immunofluorescence analysis of ZO-1; F: Immunofluorescence analysis of Occludin. *P < 0.05 vs the control. |
结果显示，HM0539降低了攻毒小鼠的死亡率和抑制了体质量下降（图 4A、B）。研究检测HM0539对攻毒小鼠小肠的影响，发现HM0539抑制了EHEC诱导的空肠绒毛萎缩和隐窝脓肿（图 4C、D）。
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图 4 在EHEC诱发的小鼠小肠结肠炎的病理过程中，HM0539减轻了临床症状和肠道炎症 Fig.4 HM0539 alleviates symptoms and intestinal inflammation in mice with EHEC -induced colitis. A, B: Percentage survival (A) and body weight changes (B) of the mice (n=10) on day 7 after EHEC infection (*P < 0.05; ****P < 0.0001). Representative images of the jejunum with HE staining (×200) are used to compare villus changes (C) and crypt abscesses (D) in the jejunum of the mice. |
本研究使用PAS染色研究HM0539对空肠中杯状细胞的影响，结果显示，EHEC能够明显减少肠中杯状细胞的数量（P < 0.01），加入HM0539进行处理后，可以显着抑制EHEC诱导的空肠杯状细胞的减少（P < 0.05，图 5A、D）。
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图 5 HM0539对EHEC感染小鼠的预防效果 Fig.5 Preventive effect of HM0539 in mice infected with EHEC. A: Representative images of the jejunum stained with PAS; B: Representative images of MUC2 expression in the jejunum with immunohistochemical staining; C: Representative images of ZO-1 expression in the jejunum with immunohistochemical staining; D: Number of goblet cells per microscopic field (×200) in the jejunum of the mice; E: Image J semi-quantitative analysis of MUC2; F: Image J semi-quantitative analysis of ZO-1. *P < 0.05; **P < 0.01. |
通过免疫组化检测小鼠肠中MUC2的蛋白表达，结果显示，HM0539+EHEC组空肠MUC2染色阳性区域面积明显大于EHEC组（图 5B、E）；Image J半定量分析结果显示，HM0539+EHEC组空肠组织中MUC2表达量显著高于EHEC组（P < 0.05）。
2.7 HM0539抑制EHEC感染小鼠肠道中ZO-1表达的下调通过免疫组化检测小鼠肠中ZO-1的蛋白表达，结果显示，HM0539+EHEC组空肠ZO-1染色阳性区域面积明显大于EHEC组；Image J半定量分析结果显示，HM0539+EHEC组空肠组织中ZO-1表达量显著高于EHEC组（P < 0.05，图 5C、F）。
3 讨论益生元最近因其对宿主健康的潜在有益作用而受到医学关注。体外研究表明，HM0539可以保护肠上皮免受LPS或TNF-α诱导的损伤，体内研究表明，HM0539不仅可以预防DSS引起的结肠炎，而且可以预防LPS/GalN引起的肠屏障功能障碍，细菌易位和肝损伤[21]。
本研究首先通过体外用HM0539处理HT-29细胞，发现其可以呈浓度依赖性地抑制EHEC对HT-29细胞的黏附和侵袭，且HM0539预处理的效果明显优于HM0539与EHEC同时处理，即提前孵育HM0539效果好于HM0539与EHEC共同孵育的效果。现有研究表明EHEC能够破坏肠道表面的MUC2，从而引起肠道疾病[22-23]。加入HM0539处理后，其能够明显抑制EHEC对HT-29细胞中MUC2的破坏。本研究通过检测紧密连接蛋白ZO-1及Occludin的表达，发现EHEC能够明显破坏细胞间的紧密连接，加入HM0539处理后，发现HM0539能够明显抑制EHEC对细胞间紧密连接蛋白的破坏。
为了进一步验证HM0539对EHEC的预防作用，本研究进行了小鼠动物实验。小鼠在感染EHEC后表现出一系列的临床症状，如食欲低下、精神萎靡、体质量明显下降，HM0539改善了小鼠的病症，对体质量下降有一定的缓解作用，但是与未感染的小鼠体质量相比，仍有一定的差距。本研究H & E染色结果显示，HM0539减轻了EHEC诱导的空肠绒毛萎缩和隐窝脓肿。肠杯状细胞和粘蛋白的主要功能是覆盖肠上皮表面的粘液层的形成，并且在保护肠上皮屏障的完整性方面起着重要作用[24]；现有研究表明，MUC2对抑制大肠杆菌入侵机体具有非常重要的作用[25-27]。本研究发现，HM0539可显着抑制EHEC诱导的小鼠肠道杯状细胞和MUC2的破坏。粘液可阻止细菌渗透，使其不能牢固地附着在空肠的上皮细胞上[28]，经口感染的EHEC可破坏空肠杯状细胞分泌的粘液，HM0539显然改变了上述情况。紧密连接蛋白在抑制致病菌易位等方面扮演重要角色，其中紧密连接蛋白ZO-1表达水平是反映细胞间紧密连接完整性的敏感指标。有研究表明，EHEC下调了小鼠肠内紧密连接蛋白的表达并增加了肠的通透性[29]。本研究发现EHEC降低了小鼠空肠中ZO-1蛋白的表达量，而HM0539抑制了EHEC对小鼠空肠中ZO-1的破坏。
目前EHEC的治疗策略主要是支持疗法[30]。现有研究认为抗菌肽和噬菌体可以治疗EHEC感染[31-34]。抗菌肽类似于抗生素具有抗菌活性，可能会诱导细菌细胞壁溶解释放预先形成的毒素，从而增加与肠壁相互作用的毒素数量[35-36]；噬菌体可能会诱导Stx基因的表达[35]。然而，这些方法都是直接作用于EHEC，不但可以引起细菌抗性，同时还会破坏肠道菌群结构，很可能对机体产生潜在的负面影响。本研究首次用HM0539预防EHEC，发现HM0539可以促进MUC2和紧密连接蛋白的表达，说明HM0539很可能是通过增强肠道屏障功能，而不是直接作用于EHEC，间接地起到预防的作用。研究表明Mucin除了可保护肠道上皮细胞免受致病菌的侵扰外，还能为肠道共生菌提供黏附位点和营养来源[37]，我们推测HM0539不仅可以预防病原菌，还可以调节肠道菌群稳态。因此，HM0539对机体不会产生潜在的负面影响，安全性更具有优势，具有更广的益生功能，为预防EHEC感染提供了新的方向。
综上所述，HM0539可作为防治EHEC感染的候选后生元制剂，开发HM0539作为防治EHEC的后生元制剂在公共卫生领域的推广及临床的应用具有重要的意义。
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