2019年12月，一群不明原因的肺炎患者被发现与中国武汉一家海鲜批发市场有关，我国科学家通过对肺炎患者的样本进行测序，发现了一种新型冠状病毒^[1]。最初，世界卫生组织于2020年1月30日建议将该病毒临时命名为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，国家卫健委于2月8日将“新型冠状病毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎(NCP)”。2月11日，国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将该病毒最终命名为SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)，其所导致的疾病被世界卫生组织命名为COVID-19 (Corona Virus Disease 2019)^[2]。流行病学数据表明，SARS-CoV-2正在发生人际传播^[3]，且人群普遍易感，自从第1位SARS-CoV-2感染者被诊断以来已经有1个多月，确诊病例、严重病例以及死亡病例数量一直在不断上升。截至2020年2月14日，我国确诊感染SARS-CoV-2的患者已多达6万余人，且全球疫情也趋于严峻。传染源主要是SARS-CoV-2感染患者，包括无症状感染者，以呼吸道飞沫和接触传播为主要传播途径，气溶胶和消化道等传播途径尚待明确^[4]。SARSCoV-2受感染患者通常表现为肺炎样症状(发热、干咳和呼吸困难等)和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至导致死亡^[5]。目前，SARS-CoV-2感染患者没有特定的治疗方法，早期诊断并及时管控是阻止疫情进一步播散和控制新感染线索的关键^[6]。因此，加强疫情监控，及时筛查并确诊SARS-CoV-2感染者是首要任务。本文对SARS-CoV-2病毒实验室诊断相关技术的最新研究进展进行综述，以期为临床医生及科研工作者提供更好地防治参考和研究思路。

病原体鉴定主要包括病毒分离和病毒核酸检测，其中病毒分离是实验室诊断病毒的“金标准”。病毒培养是诊断病毒感染的先决条件，应及时保留各种标本(如鼻咽拭子、气管抽取物、痰或肺组织、血液、粪便等)进行检测，提高下呼吸道标本的阳性率^[7]。培养分离SARSCOV-2后，利用电子显微镜技术观察病毒颗粒。目前已有多篇关于SARS-CoV-2分离鉴定的文章报道。例如：Zhu等人将3例感染患者的支气管肺泡灌洗液接种到人气道上皮细胞中进行培养分离，并初步描述了病毒分离和其特异性细胞病变的形态，其通过透射电镜和培养上清的全基因组测序成功地用于观察和检测出SARSCoV-2^[1]。Lu等^[6]同样采用特殊致病性的人气道上皮细胞(HAE)进行病毒分离，将患者支气管肺泡灌洗液或咽喉拭子接种于HAE细胞后，保持HAE细胞维持在37 ℃培养的气液界面中。每日使用光镜观察细胞病变，通过经典的科赫法则进行病毒的初步鉴定，或电子显微镜观察病毒的形态。3次传代后，收集根尖标本进行测序或收集细胞上清液用于RT-PCR检测，最终鉴定出新型冠状病毒。病毒经过纯化和鉴定后，不仅为临床诊断提供了有效的序列，同时也为今后病毒疫苗研发和抗病毒药物研制以及病毒致病机理的研究做出了重要铺垫。

众所周知，分子诊断技术早已被成功地运用于未知病毒的识别，高通量测序作为发现病原体的有力工具，同生物信息学分析一起使我们能够快速应对新型传染性疾病的暴发，提高我们对疾病发生和传播的理解，加速病原体的识别，同时进行数据共享^[8]。我国科学家利用二代测序的宏基因组学技术于2020年1月7日在短时间内从患者体内分离出SARS-CoV-2并进行了基因组测序，并临时命名为2019-nCoV。该序列已于2020年1月12日向世卫组织提供，这为不同国家的实验室生产检测新感染的特异性诊断PCR检测提供了便利^[4]。SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，作为人类已知的六种冠状病毒以外的第七种冠状病毒，其基因组特性还不完全清楚，目前已有数篇基因组测序的报道^[9]。例如，Lu等利用英国第3代测序仪(纳米孔测序仪MinION)从9名患者的支气管肺泡灌洗液样本和培养分离物中获得10条SARS-CoV-2几乎相同的序列，这些序列与2018年在中国东部舟山采集的两种蝙蝠衍生的bat-SLCoVZC45和bat-SL-CoVZXC21一致性为88%，与SARS-CoV (约79%)和MERS-CoV-2 (约50%)相差较大^[6]。Chen等^[10]提倡使用低输入元基因组测序(mNGS)方法从支气管肺泡灌洗液(BALF)中提取RNA，这可以确保有较高的丰度值，并迅速鉴定出样本中唯一的病原体。最近，Di等^[11]开发了一种基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法，该方法优化了建库的过程，同时对样本量的需求量较小，可以应用于高质量的单细胞转录组测序，或许能够提升SARS-CoV-2等样本的测序质量和速度。总体上看，基因组测序适用于最初病毒的鉴定和后期病毒的进一步研究，虽然基因组测序诊断SARS-CoV-2感染者的准确度高，当测序结果与已知SARS-CoV-2序列高度同源时便可确诊，但测序所需时间较长，设备要求较高，不适于临床快速大批量诊断。

PCR是一种基于核酸序列的分子生物学诊断技术。SARS-CoV-2的基因组为单链正RNA (+ssRNA)，因此RNA基因组需先通过反转录酶合成互补的cDNA链，再以cDNA链为基础进行PCR扩增^[12]。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是RNA逆转录(RT)与cDNA PCR相结合的技术。目前SARS-CoV-2的完整基因序列已获得，通过收集疑似SARS-CoV-2患者的上呼吸道(口咽和鼻咽)和下呼吸道(气管内吸痰、咳痰或支气管肺泡灌洗)的样本进行RT-PCR可对疑似感染SARS-CoV-2的患者进行早期诊断。其中，逆转录-绝热等温聚合酶链反应(RT-iiPCR)、实时定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)、实时RT-PCR (rtRT-PCR)、一步法RT-PCR均为RT-PCR的进一步优化^[13]。

最初，Zhu等^[1]在研究中获得3个完整SARS-CoV-2基因组，并设计了几种针对SARS-CoV-2基因组的ORF1ab、N和E 3个靶标区域的特异性和敏感性的检测方法，以检测临床标本中的病毒RNA。同时，Chu等^[14]研发了两个一步实时定量RT-PCR方法来检测病毒基因组的两个不同区域(ORF1b和N)，该方法可以实现SARS-CoV-2在人体样本中的快速检测。其研究还表明，在临床样本中用RT-PCR检测N基因的灵敏度更高。据不完全统计，国内共有80多家企业研发出了核酸检测试剂盒，截至2020年2月10日，国家药品监督管理局针对此次疫情实行应急审批并发放国家医疗器械注册证的公司有以下六家：达安基因、上海捷诺、上海之江、上海伯杰、圣湘生物、华大生物(武汉)。另外，江苏硕世取得了江苏省医疗器械注册证。由于各大厂家产品研发上市时间短，导致市场上的检测试剂盒质量良莠不齐。因此，在目前需求量极大而企业缺少时间进行必要的研发优化及用已知的临床样本进行性能验证的前提下，需要各一线实操的检验人员严谨操作和及时分享经验。通常情况下，核酸检测技术具有可早期诊断、灵敏度和特异性高等特点^[15]，但有部分病例显示，COVID- 19患者影像学的表现出现了与核酸检测结果不相符的情况，也出现了需要反复检测才出现阳性的情况。湖北省2020年2月14日根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》，将病毒阴性或未行核酸检测的患者依据其肺炎影像学特征是否符合COVID-19的特征直接纳入了湖北地区临床诊断标准^[16]。郭元元等^[17]也对6种国产SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测性能进行了比较与分析，其结果显示弱阳性患者的核酸可能不易检出，各试剂的结果存在一定的差异。最近，陈炜等人的研究显示痰标本中的病毒核酸量高于咽拭子标本，痰标本的检测效果优于咽拭子，这可能与SARSCoV-2侵袭感染下呼吸道和肺有关；由于咽拭子不易采集到足量的合格标本导致早期诊断的不准确性，因此使用咽拭子病毒核酸检测作为筛查手段需谨慎^[18]。另外，李萍等^[19]于2例患者的粪便中检测出SARS-CoV-2核酸，表明SARS-CoV-2存在粪口传播的可能。

总之，对于SARS-CoV-2核酸检测结果的准确性，需要从样本类型、标本采集保存与运输(RNA易降解)、及患者感染周期等影响因素来综合分析，了解在不同标本中病毒的含量以及出现的时间，是确诊SARS-CoV-2感染患者及判断患者治疗恢复的关键点。另外，人员操作、核酸提取、试剂盒性能等都是造成检测结果假阴性或假阳性的原因，故实验室在做好质量控制的同时结合临床评价试验数据进行分析也是重要的环节^{[13, 20]}。

近年来，以CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术在各大研究和运用领域迅速扩展，该技术可以对生物体内的基因和转录产物进行定点修饰编辑^[21]。CRISPR系统具有靶向RNA的特性，这可以鉴定检测样本中是否存在特定的序列，从而达到检测病原体的目的。其中，张锋研究团队开发的SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)系统较为经典^[22]。该团队近期还开发了升级版本的SHERLOCK系统，该技术基于CRISPR/Cas13系统，Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶，专一切割RNA，不切割DNA。研究者针对此次新型冠状病毒，设计了两个向导RNA (gRNA)，分别用于识别新冠病毒的S基因和Orf1ab基因。这样，一旦检测样本中含有新型冠状病毒，向导RNA就会识别到它的S基因和Orf1ab基因，进而引导Cas13切割这两个病毒基因。通过让被切割的RNA形成条带，形成视觉可见的检测结果^[23]。该方法结合重组聚合酶扩增技术(RPA)，能够对样本中痕量的核酸在恒温条件下进行大量扩增，因此具有灵敏度高(每微升含10~100个病毒拷贝即可检测出)、方法操作简单、1 h内检测完成等特点，如此技术实现产品化并推向市场或许会弥补现有其他技术的不足。

环介导等温扩增(LAMP)在等温核酸扩增技术中应用最为广泛，该技术所需设备简单，检测性能与实时荧光RT-PCR相近，检测时间短^[24]，但技术难度和对设备要求较高。目前，我国已有多个团队利用该技术完成了SARS-CoV-2检测试剂的研发。

核酸POCT是一种简化便携式的检测方式。操作者可在短时间内完成核酸扩增、信号收集与结果分析，并有效防止交叉污染^[25]。目前，国内已有企业如圣湘科技等公司研发出了可用于快速筛查的核酸POCT产品，这或许会为开展SARS-CoV-2的快速筛查提供便捷。

核酸质谱是一种新型软电离生物质谱分析技术^[26]，具有高灵敏度、高通量、操作简单，可同时检测多种病原体等特点，适用于呼吸系统感染性疾病病原体的鉴定。目前，国内已有企业如达瑞生物已研发出了可同时检测20多种病原体(包括SARS-CoV-2)的核酸质谱试剂盒，但该法对仪器设备和人员资质等技术要求较高。

免疫胶体金技术因其具有操作方便快速，实用性强等特点在基层医疗单位及现场检测等广泛使用^[27]。目前已有多家生物公司研发出检测SARS-CoV-2IgM和IgG抗体的胶体金试剂(免疫层析法)，这为新型冠状病毒感染的辅助诊断和流行病调查提供了一个极好的检测手段。但免疫胶体金法的敏感度和特异性会较核酸检测弱，假阳性率、假阴性率出现的概率会更高，且存在窗口期。

化学发光免疫分析技术具有特异性高、线性范围宽、速度快等特点，一直广泛应用于临床样本的检测^[28]。目前国内已有深圳亚辉龙等公司研发出了化学发光试剂盒用于检测新型冠状病毒IgM、IgG抗体及抗原，这对临床实验室是个好消息，可实现自动化批量检测。

ELISA通常用于进展期和恢复期患者血清病毒的抗体检测^[29]，但检测速度慢，步骤繁琐，目前临床使用较少。

血清免疫技术作为分子生物技术之外的另一种技术，其临床实验室的操作要求相对要低，适用于筛查及流行病学调查，但其敏感性、特异性、临床应用效率还需要进一步的验证和评估。对于新型冠状病毒核酸检测出现假阴性的情况，可以结合血清SARS-CoV-2特异抗体(IgG/IgM)检测，这可以明确患者是否近期或既往感染过SARS-CoV-2，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。

SARS-CoV-2是自埃博拉、寨卡和禽流感以及猪流感病毒后又一严重危害人类公共卫生安全的新病毒，这使得SARS-CoV-2在短时间内成为全球关注的焦点^[30]。好消息是，成功的病毒分离为开发更好的诊断方法和有效的疫苗打开了大门。目前SARS-CoV-2感染患者没有特定的治疗方法，早期诊断并进行控制显得至关重要，因此，研发出快速和准确的检测方法成为首要任务。本文对SARS-CoV-2实验室诊断相关技术研究进展及临床应用进行了综述，其中，分子生物学技术具有特异性高、敏感性强等特点，为SARS-CoV-2的鉴定提供了精准迅速的检测方法，并为疫情的防控提供有效的流行病学信息。临床应用时需结合病原微生物学及免疫学等相关检测技术，提倡多技术相结合，取长补短，增强实用性，提高病毒的快速明确诊断和鉴别诊断的能力。