2020, Vol. 40
系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的以免疫性炎症为突出表现的结缔组织疾病。近年来多研究表示SLE患者为维生素D缺乏高发人群[1]，体内维生素D的低水平状态可能会加重SLE患者的免疫异常[2-3]。而单核趋化蛋白-1（MCP-1）被认为可能是反映SLE活动性的重要指标[4-5]，目前已有学者就MCP-1与SLE维生素D缺乏的相关性进行探讨，发现维生素D以剂量依赖性方式抑制SLE患者外周血单个核细胞（PBMC）表达MCP-1，但持续增加维生素D的干预剂量并不能完全抑制MCP-l表达[6]。由于维生素D需与维生素D受体（VDR）结合后发挥相应的生物效应，通过我们前期试验已证实VDR在SLE的免疫系统稳态中可能也发挥重要作用[7]，目前关于SLE患者PBMC的VDR的表达与MCP-1表达之间的相关性研究暂未见报道，我们将通过检测SLE患者的PBMC的VDR、MCP-1以及血清中MCP-1的表达，分析VDR与SLE疾病活动度的关系，探讨VDR与趋化因子MCP-1两者之间的关系，为临床治疗SLE提供新的方向。
1 资料和方法 1.1 研究对象选取2014~2015年我院肾脏风湿科住院SLE患者60例，其中女性53例，男性7例，年龄39.8±12.4岁。同时选取年龄、性别匹配的健康人28例标记为对照组，女性25例，男性3例，年龄39.4±7.9岁，均无免疫性疾病及其他疾病史。研究对象均签署了知情同意书，并获得了中南大学医学伦理中心批准。
1.2 诊断标准纳入标准：所有患者均符合1997年美国风湿协会（ACR）制定的SLE分类诊断标准[8]。排除标准包括：（1）有明确的其他免疫性疾病；（2）合并有急性或慢性感染疾病；（3）孕妇及哺乳期妇女；（4）乙肝表面抗原阳性患者；（5）糖尿病等慢性代谢性疾病；（6）有明确的恶性肿瘤病史。
1.3 实验分组入组的SLE患者根据SLE疾病活动指数评分（SLEDAI）[9]分为SLE活动组：SLEDAI>4分，36例；SLE非活动组：SLEDAI≤4分，24例[10]；正常对照组：健康人28例。
1.4 PBMC的分离收集抗凝的外周静脉血5 mL于EDTA抗凝管，按1:1比例用PBS缓冲液稀释血液，加入5 mL淋巴细胞分离液，使二者界面清晰，然后4 ℃，2000 r/min，离心20 min，再用移液器将血浆层与分离液间的白色雾状层吸出，将其移入另一离心管中，加入10 mL的PBS混匀，在4 ℃及1500 r/min条件下离心10 min，弃上清，再重复洗涤1次。提取的外周血单个核细胞1部分用于RNA的提取，1部分用于蛋白的提取。
1.5 Real-time PCR及结果分析根据TRIzol法提取PBMC的总RNA，RNA浓度（µg/µL）=A260 nm×稀释倍数×40/1000：（1）反转录：按照Fermentas cDNA反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA备用；（2）Real-time PCR：按照说明书所述的步骤配置10 μL Real-time PCR反应体系，分别为：上游引物（10 μmol/L）0.5 μL；下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、PCR H2O 3 μL、2X SYBGREEN PCR Master Mix 5 μL；反转录产物1 μL；Real-time PCR反应参数：预变性95 ℃ 2 min，变性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环，然后72 ℃延伸5 min[11]；引物序列：在NCBI上搜索目的基因的序列，运用primer5软件设计引物（表 1）。选择β-actin作为内参，并采用计算2-△△CT值[12]方法进行表达量相对定量分析。
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表 1 各引物序列及长度 Tab.1 Sequence and length of each primer |
SLE患者活动组、非活动组、健康对照组各组随机选15例提取PBMC总蛋白后用BCA法测定细胞蛋白浓度，取20 μg蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后用转膜缓冲液浸泡，按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序依次叠好，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h；将膜与一抗（1:1000稀释）密封后置摇床4 ℃过夜孵育，次日用TBST溶液洗3次膜后，15 min/次；将膜置入二抗（1：4000稀释）摇动孵育1 h，再次用TBST溶液洗膜3次，15 min/次。使用ECL化学发光试剂处理并暗室内显影后，通过quantity one专业灰度分析软件对图片条带面积和灰度值进行分析，计算VDR蛋白灰度值与内参灰度值之比，即为VDR蛋白的相对表达水平。
1.7 ELISA方法检测MCP-1血清浓度外周血MCP-1浓度的检测严格按照MCP-1检测试剂盒说明书进行。
1.8 统计学方法使用SPSS17.0统计软件进行数据资料统计分析，计量资料数据以均数±标准差表示，两组间计量资料比较采用t检验，3组间比较时采用单因素方差分析，各因素间进行相关分析采用Person相关分析，以α=0.05为检验水准，P < 0.05时差异有统计学意义。
2 结果 2.1 SLE患者PBMC的VDR表达 2.1.1 SLE患者VDRmRNA的相对表达量正常对照组、SLE活动组、SLE非活动组PBMC的VDRmRNA相对表达量（图 1）。SLE活动组与SLE非活动组VDRmRNA相对表达量显著低于正常对照组（P < 0.01），与SLE非活动组相比，SLE活动组PBMC VDR mRNA的相对表达量降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。
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图 1 正常对照组、SLE活动组及非活动组VDRmRNA的表达水平比较 Fig.1 VDR mRNA expression levels in control group, active SLE group and inactive SLE group (Mean ± SD). **P < 0.01 vs control group. #P < 0.05 vs SLE activity group. |
正常对照组、SLE活动组、SLE非活动组VDR蛋白表达（图 2）。SLE活动组、SLE非活动组VDR蛋白表达水平较正常对照组明显降低，差异具有显著统计学意义（P < 0.01），SLE活动组VDR蛋白低于SLE非活动组，差异有统计学意义（P < 0.05）。
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图 2 正常对照组、SLE活动组及非活动组VDR蛋白的表达水平 Fig.2 VDR protein expression levels in control group, SLE active group and inactive group. A Comparison of VDR protein expression levels in control group, SLE active group and inactive group(Mean ± SD); B: western blot analysis of VDR protein expression in each group. **P < 0.01 vs control group. #P < 0.05 vs SLE activity group. |
正常对照组、SLE活动组、SLE非活动组的PBMC的MCP-1 mRNA相对表达量及血清MCP-1水平（表 2）。SLE活动组与SLE非活动组MCP-1 mRNA相对表达量及血清水平均显著高于正常对照组（P < 0.01），与SLE非活动组相比，SLE活动组PBMC的MCP-1 mRNA的相对表达量及血清MCP-1水平增加，差异具有统计学意义（P < 0.05）。
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表 2 SLE非活动组、活动组及正常对照组MCP-1的表达比较 Tab.2 Comparison of expression of MCP-1 in SLE inactive group, SLE active group and control group (Mean±SD) |
将VDR mRNA与SLEDAI进行相关分析，结果显示：VDR mRNA与SLEDAI成负相关（r=- 0.417，P= 0.001，图 3）。
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图 3 VDR mRNA表达水平与SLEDAI的相关性分析 Fig.3 Correlation analysis between VDR mRNA expression level and SLEDAI (n=60). |
将VDR mRNA与MCP-1进行相关分析，结果显示：VDR mRNA与MCP-1 mRNA成负相关（r=-0.554，P=0.000，图 4）。VDR蛋白与血清MCP-1水平呈负相关（r=-0.400，P=0.028，图 5）。
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图 4 VDR mRNA表达水平与MCP-1 mRNA表达水平的相关性分析 Fig.4 Correlation analysis between VDR mRNA expression level and MCP-1 mRNA expression (n=60). |
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图 5 VDR蛋白表达水平与MCP-1血清浓度的相关性分析 Fig.5 Correlation analysis between VDR protein expression level and MCP-1 serum concentration (n=30). |
免疫功能的紊乱在SLE的发病进展中是一个非常重要的步骤。维生素D已被多研究证实参与SLE免疫炎症反应[13-15]，并通过所有免疫细胞中表达的VDR产生基因效应来发挥重要作用。VDR位于细胞核内，为亲核蛋白，本质上是一个依赖配体的转录因子，它的表达可能受遗传、microRNA、表观遗传及体内活性维生素D水平等多重因素的调控[16-18]。既往研究多涉及VDR基因多态性与SLE的关系[19-20]，近年有学者提出1，25（OH）2D3和VDR均可调节不同T细胞亚群中的细胞因子分泌来降低炎症因子的表达[2]，并发现可以通过介导PKCδ/ ERK（蛋白激酶Cδ/细胞外信号调节激酶）途径激活CD4+ T细胞及抑制CD4+ T细胞过度活化，从而缓解SLE自身免疫反应[21]。我们的前期试验也证实单核细胞和T淋巴细胞系中，SLE患者的VDR表达被TNF-α抑制后下调，可能影响着病情的进展[7]，故认为VDR的表达变化可能参与SLE的免疫炎症反应并发挥重要作用。
在本研究中，SLE患者PBMC的VDR mRNA及蛋白水平表达均明显下降，且以SLE活动期的VDR表达下降为著，这与国内相关报道并不一致[22]，但可能与研究的对象不同有关，郑一君等[22]学者所选取的均为我国未服用过激素治疗的初发患者，而我们并未将病情初发作为研究的SLE患者纳入标准。另通过相关分析发现VDR与SLEDAI呈负相关（r=-0.417，P=0.001），处于SLE活动状态的患者VDR表达低下，表明VDR的表达可以作为反映SLE疾病活动程度的指标，提示VDR的表达下调可能增加SLE的风险。而有关VDR mRNA的表达下调的机制，有研究指出VDR mRNA在人原代B细胞中以低水平组成型表达，并且在1，25（OH）2D3存在下以时间依赖性方式增强[23]，所以当体内维生素D缺乏时，可能导致维生素D介导VDR上调作用受到抑制。另也有学者提出在中国人群中VDR基因多态性发现与SLE发病易感性有关，且B等位基因、F等位基因可能在VDR基因转录中发挥负调节作用，通过下调VDR mRNA的表达影响病情变化[24-25]。
MCP-1又称为单核细胞趋化和活化因子，是控制单核细胞和巨噬细胞迁移过程的关键蛋白，主要与Th2细胞介导的免疫反应有关。Hao W等学者证实MCP-1在SLE中可以通过结合CRR2激活相关信号通路，促进细胞因子释放引起炎症反应导致组织器官损伤[26]。大部分研究表明血清MCP-1水平与活动性狼疮性肾炎相关，并认为与健康人相比，SLE患者PBMC的MCP-1 mRNA及血清中MCP-1表达呈上调趋势[27-28]，提出MCP-1参与SLE病程进展及可能是提示SLE病情活动性的一项指标，我们实验结果与此相一致。我国学者进一步提出25（- OH）D3对SLE患者PBMCS的MCP-1表达存在剂量依赖性抑制，但大剂量维生素D仍未能完全抑制MCP-1的表达[6]。Wang等[29]学者则提出1α，25（- OH）2D3至少部分是通过VDR对MCP-1产生的抑制作用的观点，另在糖尿病肾脏病模型中也发现VDR活化剂的使用可以降低肾脏mRNA中MCP-1的表达，认为MCP-1基因的启动子的上有核转录调节因子核因子-kappaB（NF-κB）的结合位点，而VDR对经典NF-κB的转录靶MCP-1的表达可能存在负调节作用[30]，本研究对结果进行相关性分析时也显示VDR的表达与MCP-1呈负相关，以上均佐证了VDR对MCP-1存在影响的推断。因此本研究可能进一步补充解释了SLE患者的MCP-1表达未能完全被维生素D抑制的事实，但目前尚未有研究明确VDR激活剂对SLE炎症反应有无改善作用，还需要更大规模的临床研究来证实VDR与MCP-1的关系及更深入的细胞实验和动物模型研究来探讨VDR对SLE炎症反应的影响，从而提供未来靶向治疗的新途径。
综上所述，本研究结果显示SLE患者PBMC的VDR的低表达与疾病的活动程度呈负相关，我们研究进一步发现VDR表达与趋化因子MCP-1呈负相关，提示SLE的发病机制中VDR对MCP-1的表达可能存在影响关系。
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