牙周炎是糖尿病的并发症，糖尿病患者患重度牙周炎的风险比普通人群高8.53倍，血糖控制水平与牙龈炎症程度和牙周破坏程度相关^[1-2]。目前国际共识认为两者之间的联系集中在炎症信号通路上，主要有炎症因子IL-1、TNF-α、IL-6，NF-κB配体，toll样受体（TLR 2/4），AGEs-RAGE的结合等^[3]。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种重要的晚期炎症介质，也是晚期糖基化终产物受体（RAGE）的重要配体，近几年发现与牙周炎相关^[4-5]。HMGB1-RAGE结合会激活转录因子NF-κB，引发促炎因子TNF-α等的进一步释放，体外实验发现牙周韧带细胞和破骨细胞都存在有HMGB1/RAGE信号轴^[6]，但其和糖尿病伴发牙周炎的关系研究还处于空白中。肝脏是重要的免疫器官，也是重要的糖代谢器官，在炎症和代谢紊乱中扮演了重要的调控作用^[7-8]。因此，本研究同时讨论了HMGB1-RAGE在糖尿病牙周组织炎症中的存在性，以及和肝脏脂代谢之间的关系。

牙龈卟啉单胞菌W83（口腔疾病研究国家重点实验室），高脂饲料（斯莱克），链脲佐菌素（STZ, Sigma），GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒（基因科技），兔单克隆抗体RAGE抗体和兔单克隆抗体HMGB1抗体（Abcam），兔多克隆抗体TNF-α抗体（Bioworld），BX53显微镜及照相系统（Olympus），罗氏活力^®血糖仪。

4~6周龄清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，分为4组：（1）空白对照组（NC组）；（2）糖尿病组（DM组）；（3）牙周炎组（CP组）；（4）糖尿病+牙周炎组（DM+CP组），每组25只，于四川大学华西医学实验动物中心清洁级环境饲养。

饲养第7周，禁食12 h，7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，4-0不可吸收丝线结扎右上颌第二磨牙牙颈部。术后口内滴注P.gingivalisW83（×10⁹ CFU/mL）活菌悬液0.1 mL（每周3次），共结扎6周，诱导实验性牙周炎。第13周，处死取右侧上颌骨组织样本。

高脂饮食喂养4周后，禁食12 h，腹腔1次性注射1% STZ（25 mg/kg），pH4.2~4.6，术后2 d采用4%低渗葡萄糖水，后改为普通食水喂养。每周检测随机血糖进行并记录体质量，随机血糖大于13.9mmol/L即认为达标。注射1周后血糖不达标的大鼠，再次腹腔注射1% STZ（25 mg/kg），1周后再不达标者弃用。第13周，右心室负压取血，静置30 min后离心，吸取上层血清，分装，-80℃保存备用。

带牙龈及软组织的上颌骨样本去除丝线，于4 ℃的多聚甲醛固定48 h，10% EDTA常温脱钙，冲洗、脱水、透明、浸蜡后包埋，切片，脱蜡、脱水后苏木精-伊红（HE）染色，免疫组化染色，光学显微镜进行组织学观察。

取分装好的血清样本，冰盒保存送至四川省人民医院检验科，全自动生化仪光谱法检测血清脂代谢相关指标低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和肝损伤血清生化指标谷丙转氨酶（ALT）。

BX53显微镜及照相系统（Olympus）统一曝光时间和亮度，随机选取400倍高倍镜下的5个视野进行拍摄。Image J1.51软件处理图片，统一图片背景，阈值，计算出每个视野面积中阳性表达面积所占的百分比（%Area），取平均值作为此标本的免疫组化染色阳性表达数值。

应用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，实验统计数据用均数±标准差表示，实验数据先做正态检验和方差齐性检验，两项检验合格，组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

NC组、DM组未见明显牙周组织破坏，CP组及DM+CP组牙龈上皮炎性增生，有明显的炎细胞浸润，结合上皮根向增殖，牙槽骨破坏吸收（图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 牙周组织切片HE染色 Fig.1 HE staining of the periodontal tissue in different groups. R: Root; B: Bone.

DM组、DM+CP组术后第3周随机血糖全部超过阈值13.9 mmol/L，后续的4、5、6周随机血糖稳定维持在13.9 mmol/L以上（图 2A）。NC组大鼠体质量随时间增加，而DM组、DM+CP组大鼠体质量均逐渐降低（图 2B）。

图 2(Fig.2)

图 2 大鼠血糖和体质量变化 Fig.2 Blood glucose and body weight changes of the rats in control group (NC), diabetes group (DM), and diabetes and periodontitis group (DM+CP). A: Scatter plot of random blood glucose changes before and after modeling in diabetic rats (n=5); B: Histogram of body weight changes in each group.

400倍光镜下4组大鼠牙周组织HMGB1、RAGE、TNF-α免疫组化染色显示：NC组HMGB1，RAGE，TNF-α 3个指标均着色很浅，少见阳性细胞；DM组未感染P. gingivalis，HMGB1仍有广泛的阳性表达，染色主要集中在胞核，HMGB1阳性细胞比较均匀地分布在牙周组织的各个部位，同样，RAGE也可见广泛的胞膜棕染，但TNF-α阳性表达不明显；CP组HMGB1在胞核、胞浆以及胞外都可见明显的棕染，RAGE未见明显胞膜棕染，TNF-α阳性表达明显；DM+CP组3个指标的阳性表达都高于其他组，HMGB1在胞核、胞浆以及胞外都可见明显的棕染，RAGE可见广泛的胞膜棕染，与DM组类似，TNF-α阳性表达最明显，牙龈染色最深，根方的牙周膜染色稍浅。

4组HMGB1、RAGE、TNF-α免疫组化染色阳性表达面积百分比（%Area）可见：DM组HMGB1、RAGE阳性表达面积百分比显著性高于NC组（P < 0.05），但TNF-α表达和NC组表达无差异（P>0.05）；CP组HMGB1和TNF-α的阳性表达面积显著性高于NC组（P < 0.05），而RAGE的阳性表达面积与NC组没有显著性差异（P>0.05），且显著低于DM组及DM+CP组（P < 0.05）DM+CP组HMGB1、RAGE、TNF-α三个指标阳性表达面积百分比均显著高于NC组（P < 0.05），其中TNF-α阳性表达面积最高，对比NC组、DM组及CP组都有统计学差异（图 4，P < 0.05）。

图 4(Fig.4)

图 4 大鼠牙周组织中HMGB1，RAGE，TNF-α免疫组化染色平均阳性面积比率 Fig.4 Comparison of the areas with positive immunohistochemical staining of HMGB1, RAGE, and TNF-α in periodontal tissues. *P < 0.05, **P < 0.01.

CP，DM+CP组中，分别出现多项脂代谢及肝损伤指标异常。DM组高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、谷丙转氨酶ALT、甘油三酯TG和总胆固醇TC均显著高于空白对照组（P < 0.05）。CP组谷丙转氨酶ALT显著性高于对照组，而DM+CP组在高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、谷丙转氨酶ALT和总胆固醇TC两项数据上显著高于空白对照组（图 5，P < 0.05）。

图 5(Fig.5)

图 5 大鼠脂代谢相关血清生化指标HDL-C、LDL-C、TC、TG和肝损伤血清指标ALT浓度 Fig.5 Comparison of the biochemical indicators among the 4 groups. *P < 0.05, **P < 0.01.

腹腔注射STZ是建立动物糖尿病模型的常规方法，注射剂量不一（27.5~75 mg/kg），注射方式也分一次性腹腔注射和小剂量连续多次腹腔注射^[9-10]。文献中多用一次性腹腔注射STZ（45~65 mg/kg）^[10]，也有用高脂饮食诱导+一次性小剂量STZ腹腔注射（27.5~35 mg/kg）建模成功的例子^[11]。结合文献，我们选用高脂饮食诱导4周+一次性小剂量STZ腹腔注射（25 mg/kg）建立大鼠糖尿病模型。

大鼠糖尿病建模成功的标准不一，主要有3类标准：空腹血糖≥11.1 mmol/L，血糖≥13.9 mmol/L（250 mg/dL），血糖≥16.7 mmol/L（300 mg/dL）^[10]。根据临床糖尿病的诊断标准，有高血糖症状（多饮、多尿、多食，体质量减少）和随机血糖检测≥11.1 mmol/L即可诊断为糖尿病^[12]。结合临床诊断标准和文献，本实验大鼠腹腔注射STZ术后1周，大部分大鼠随机血糖已经超过阈值13.9 mmol/L，第3周至实验结束，大鼠随机血糖全部高于13.9 mmol/L，并且出现多饮多尿症状，体重减轻，糖尿病建模成功。

图 3(Fig.3)

图 3 大鼠牙周组织中HMGB1、RAGE、TNF-α的表达 Fig.3 Expression of HMGB1, RAGE, and TNF-α in periodontal tissues in the 4 groups (Original magnification: ×400).

高糖状态导致末端糖化产物AGEs在牙周组织中的累积，导致局部RAGE表达上调，激活下游NF-κB信号通路，引起局部TNF-α等细胞因子的表达升高，导致结缔组织破坏和骨吸收，加重牙周炎症进程^[13-14]。本实验中所有糖尿病大鼠牙周组织均高表达RAGE，对照组大鼠及牙周炎大鼠牙周组织中则几乎不表达，且DM组、DM+CP组组间RAGE阳性表达面积没有明显差异，说明RAGE表达主要和糖尿病相关，本研究中没有发现牙周炎促进RAGE表达的证据，与临床研究结果一致。如Aemaimanan等^[15]检测2型糖尿病伴发牙周炎患者牙龈组织中RAGE的分布显著高于慢性牙周炎患者。俞宁等^[16]发现RAGE的基因多态性在2型糖尿病伴慢性牙周炎、单纯慢性牙周炎、健康对照人群中分布无差异，RAGE基因并非2型糖尿病以及慢性牙周炎的易感基因。本实验数据也提示牙周组织中RAGE表达水平的高低，主要与血糖相关，与牙周炎症没有显著联系。糖尿病状态下牙周组织RAGE表达上升，就可能激活下游的NF-κB炎症信号通路，提示RAGE可能参与糖尿病患者牙周炎症的发生发展过程^[17]。

HMGB1是重要的晚期炎症介质，在维持炎症反应中起重要作用^[18-19]。HMGB1和牙周炎相关，Nogueira等^[5]在体外用LPS和IL-1刺激牙周韧带细胞，检测到HMGB1 mRNA和HMGB1表达量的显著性升高。大鼠牙周炎模型中，牙周组织中HMGB1的表达和牙周破坏程度正相关。Xie等^[20]在临床实验中检测了慢性牙周炎、广泛性侵袭性牙周炎、种植体周围炎患者的龈沟液和牙龈组织，发现HMGB1高表达，说明HMGB1在牙周组织中的表达受牙周炎症影响。本研究发现DM组、DM+CP组和CP组牙周组织中HMGB1均高表达，说明单纯的牙周局部炎症，单纯的高血糖状态以及高血糖复合牙周炎的状态，均会导致牙周组织表达HMGB1。

在CP组中，我们发现HMGB1表达的显著性升高，TNF-α的表达也显著性升高，同时不伴有RAGE表达的显著性升高。推测在单纯牙周炎状态下，HMGB1的升高可能并没有激活RAGE的表达。回顾文献可以发现，在炎症刺激下，HMGB1释放到胞外，其主要受体为（1）HMGB1与RAGE的结合；（2）与TLR-2，TLR-4结合，激活下游信号通路，介导慢性炎症发生^[21-22]，推测CP组HMGB1升高，可能是通过激活TLR-2，TLR-4介导TNF-α表达，该结果尚需进一步证实。

本研究发现糖尿病伴发牙周炎的大鼠牙周组织中HMGB1、RAGE的表达最高，牙周破坏最重，TNF-α表达最高，提示HMGB1/RAGE信号轴是糖尿病伴发牙周炎的重要炎症通路中的一环。同时，糖尿病大鼠的牙周组织中也检测到了HMGB1、RAGE的高表达，但是HE染色在光镜下未观察到明显病理性变化，TNF-α表达也类似健康对照。推测其原因为糖尿病大鼠牙周组织中HMGB1-RAGE表达升高后，使炎症信号更容易被放大，导致糖尿病状态下对牙周炎易感，但没有局部菌斑刺激，并没有出现明显炎症反应。

流行病学调查显示，牙周炎和糖尿病，肝脏疾病都相关，肝脏是重要的糖代谢器官，也是重要的免疫器官，在炎症和代谢紊乱中扮演了重要的调控作用^[25-26]。我们猜测在牙周炎状态下，肝脏可能参与到糖尿病与牙周炎的双向关系中。糖代谢紊乱常伴有血脂代谢的异常，脂代谢相关指标HDL-C、LDL-C、TC、TG，是机体代谢紊乱的指标，与糖尿病前期状态密切相关^[21-22]，结合肝损伤血清生化指标ALT，可以观察肝脏的功能变化。课题组前期实验和本次研究在牙周炎及P.gingivalis多次尾静脉注射的刺激下，暂时未发现大鼠肝脏炎症性病理改变^[27]，在该状态下，DM，CP及DM+CP各组均已出现HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALT等多项肝脏代谢指标异常。其中能反映肝细胞损伤程度及坏死情况的ALT在3组中均出现显著性表达异常，说明在高血糖、牙周炎及高血糖复合牙周炎状态时，即使未见肝脏明显炎症性变化，肝脏功能仍出现一定程度损伤。目前有大量研究显示，ALT水平升高与糖代谢异常具有而一定相关性^[28]，也是全身炎症活化和氧化应激增加的独立标志物^[29]。在本研究中，在DM及DM+CP组中均发现ALT表达升高，说明在高血糖状态肝脏出现功能损伤。在CP组中，ALT也有异常高表达，分析其原因，可能为牙周炎状态导致的全身慢性炎症状态引起，其具体机制仍需进一步研究。

本实验通过分析大鼠牙周组织中HMGB1，RAGE，TNF-α的表达，结合HE染色结果和血清HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALT浓度，发现牙周局部炎症和糖尿病均可导致牙周组织HMGB1的高表达，进而介导炎症发生，而RAGE的表达仅与糖尿病相关。HMGB1和RAGE共同参与了糖尿病大鼠的牙周炎症进程，并可能是造成糖尿病对牙周炎易感的因素之一。在牙周炎和高血糖的状态下，肝脏功能也出现一定程度的损伤，其机制尚需进一步研究。