子宫内膜癌高发于绝经后的50~60岁女性，易发生阴道不规则出血，故多数患者（约75%）能在疾病早期确诊，手术或放射治疗效果较好，5年早期患者总生存率在70%以上^[1-2]。对于中晚期患者，化疗（新辅助化疗、辅助化疗和姑息化疗等）是关键的治疗方法，其中铂类+紫杉醇类是首选的化疗方案^[3-4]，但是化疗不敏感及诱导耐药的情况时有发生，晚期患者5年总生存率仅为25%^[5-6]。对的生物标志物及克服其耐受的治疗方法，具有重要的临床现实意义，同样是国内外研究的重点^[7-8]。本课题组前期利用全基因组拷贝数变异（CNV）分析的方法，筛选出白血病相关因子（LIF）可能与子宫内膜癌患者化疗抵抗相关^[9]，但迄今未见LIF参与子宫内膜癌化疗抵抗的机制报道，缺少LIF作为子宫内膜癌临床治疗的生物标志物及靶点的前期研究，因此，本研究通过体外模型，旨在探索LIF对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响，以期为子宫内膜癌的诊治提供新的思路。

MEM培养液、DMEM/F12培养液、Opti-MEN培养液、胎牛血清（FBS）为100 ×青霉素-链霉素（P/S）、Lipofectamine 3000、针对LIF的酶联免疫吸附检测试剂盒（ThermoFisher）；胰岛素（Merck）；嘌呤霉素（Puro）、顺铂和紫杉醇（阿拉丁）；CCK-8试剂盒（同仁）；Annexin V-FITC/PI检测试剂盒（凯基）；JC-1检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液，蛋白酶抑制剂混合物和蛋白磷酸酶抑制剂混合物（碧云天）；针对Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bad、STAT3、p-STAT3（Y705）和α-tubulin的抗体（Cell Signal）；非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒、总RNA提取试剂（Trizol法）、HiScript cDNA一链合成试剂盒和ChamQ高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒（诺唯赞）。Synergy2多功能酶标仪（BioTek），MiniProtean电泳、Mini Trans-Blot转膜设备和CFX96荧光定量PCR系统（BIO-RAD），HD9 Touch多功能成像系统（UVITEC），Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）。

两子宫内膜癌细胞（HEC-1B和RL95-2）及用于病毒包装的293FT（普诺赛）均通过STR鉴定，经规范培养、传代扩增后，冻存于江门市中心医院中心实验室（临床生物资源库）的液氮罐中。HEC-1B的完全培养基为含10% FBS和1% P/S的MEM培养液，RL95-2的完全培养基为含10% FBS、5 mg/L胰岛素及1% P/S的DMEM/F12培养液；细胞换液、传代、冻存及复苏均按常规操作，所有细胞的培养环境均为，5% CO₂，37.5 ℃恒温恒湿。

人HLF基因，转录本编号NM_002309，购自山东维真公司，并利用快速克隆试剂盒构建进pLVX-IRESPuro慢病毒载体质粒；psPAX2（#12260）和pMD2.G（#12259）购自Addgene；pSTAT3-TA-luc、pGL6-TA-luc和pRL-SV40-N质粒购自上海碧云天公司；针对STAT3的小干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA; #siB0837165849）及对照siRNA片段（#siN0000001）均由广州锐博公司设计和合成。质粒和siRNA的转染均使用Lipofectamine 3000脂质体转染系统，操作按试剂说明书操作。

如课题组前期报道^[10]所述，转染前夜，消化传代293FT细胞，接种于包被好明胶包被好的培养介质，5% CO₂，37 ℃培养过夜，确认细胞状态良好；按15:8:12比例混合pLVX-IRES-Puro、pMD2.G和psPAX2，按说明书操作，利用Lipofectamine 3000转染混合物，5% CO₂，37 ℃正常培养6 h；弃去培养液，轻柔地用预热好的PBS洗涤细胞表面3次，再小心加入完全培养基，正常培养；转染过夜后，开始收集培养液上清，0.2 μm微孔滤膜过滤后，可直接感染细胞或置-80 ℃短期保存。感染前夜，消化传代目标细胞，正常培养过夜，确认细胞状态良好；弃去原培养液，加入已过滤的含病毒培养液，正常培养，每6~10 h换含病毒的培养液1次，连续3 d；感染结束后，换完全培养液正常培养1 d，待细胞状态恢复并长至90%融合度，传代并冻存；传代过夜的细胞，加入0.1~10 mg/L含Puro筛选培养液，正常传代培养两代即可。利用RT-qPCR及ELISA方法确定稳定表达HLF细胞的成功建立。

如课题组前期报道^[11]所述，细胞的总RNA提取用Trizol法提取，操作按试剂说明书操作。用cDNA第一链合成试剂盒，按说明书操作，将总RNA逆转录（RT）成cDNA。实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）的扩增和定量使用的是CFX96系统的SYBR Green法，试剂盒为ChamQ SYBR高灵敏性定量PCR检测试剂盒，操作按产品说明书执行。其中使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，采用2^-△△Ct计算目的基因的相对表达量。LIF的上游引物为：5'-GCATCT GAGGTTTCCTCCAA-3'，下游引物为：5'-TTCCAGT GCAGAACCAACAG-3'；GAPDH的上游引物为：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物为：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

如课题组前期报道^[12]所述，细胞总蛋白提取使用RIPA裂解液，使用前加入蛋白酶抑制剂混合物及蛋白磷酸酶抑制剂混合物，冰上裂解15 min、超声破碎30 s；蛋白定量用BCA蛋白定量试剂盒，并按说明书操作。裂解液上样前加入按5:1加入6×上样缓冲液，并用1×上样缓冲液配平体积，100 ℃变性处理5 min。使用SDSPAGE蛋白电泳系统，上样量为50 µg总蛋白，电泳参数为8%~12%分离胶、5%浓缩胶，100 V电泳120 min至溴酚蓝指示剂迁移至底部后，进行电转移，使用0.2 µm的PVDF膜，300 mA冰浴电转90 min。电转结束后，膜使用5%脱脂奶粉封闭30 min，TBST漂洗1遍5 min，加入稀释的一抗工作液（按产品说明书稀释配制），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3遍5 min，加入稀释的二抗工作液（按产品说明书稀释配制），室温孵育1 h，TBST漂洗3遍5 min，加入ECL发光液，多功能成像仪自动成像。

如课题组前期报道^[13]所述，酶联免疫吸附试验（ELISA）参考产品说明书，提前配置好洗液、分析缓冲液、生物素标记的抗体工作液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液及LIF的系列浓度的标准品溶液。首先用洗液活化包埋针对LIF抗体的酶标板各检测孔，加入样品及标准品溶液，室温孵育2 h，弃上清后洗涤检测孔；然后加入生物素标记的抗体工作液，室温孵育1 h，弃上清后洗涤检测孔；随后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，室温孵育30 min，弃上清后洗涤检测孔；再加入TMB底物工作液室温避光显色10 min，即加入反应终止液。在酶标仪上，检测各孔450 nm的吸光度，并用620 nm作为参比波长，利用标准曲线法求算各样品的LIF浓度。

如课题组前期报道^[14]所述，采用96孔板作为培养介质，细胞消化、计数并铺板，接种密度约为5 000 cells/ well，置37 ℃细胞培养箱，5% CO₂培养6 h；培养结束后，在0 h时间点孔，加入1/10培养液体积的CCK-8溶液，正常培养条件孵育1 h，用酶标仪测定450 nm吸光度，继续正常培养24、48、72 h；培养结束后，如上操作，测定各时间点孔的450 nm吸光度，按下列公式计算：

如课题组前期报道^[15]所述，细胞凋亡的检测采用Annexin V-FITC/PI检测试剂盒，操作按产品说明书执行。按实验分组处理细胞规定时间后，消化收集细胞，依次孵育Annexin V-FITC和PI染液，流式细胞分析仪检测，调整并收集每个样品的前散射光（FSC）、侧散射光（SSC）、绿光（Annexin V-FITC）和橙光（PI）4个通道的信号，并以FSC/SSC作散点图圈出主细胞群，再以Annexin V-FITC/PI对主细胞群作图分出Annexin V-FITC阳性、PI阴性或阳性的凋亡细胞群，定义为凋亡细胞。

如课题组前期报道^[16]所述，细胞线粒体膜电位采用JC-1检测试剂盒，操作按产品说明书执行。按实验分组处理细胞规定时间后，消化收集细胞，孵育JC-1染液，流式细胞分析仪检测，调整并收集每个样品的前散射光（FSC）、侧散射光（SSC）、绿光（JC-1 Green）和红光（JC-1 Red）四个通道的信号，并以FSC/SSC作散点图圈出主细胞群，再以JC-1 Green/Red对主细胞群作图分出JC-1 Green阳性、JC-1 Red阳性的高线粒体膜电位细胞。

如课题组前期报道^[17]所述，在Opti-MEN培养液中，分别将pSTAT3-TA-luc和pGL6-TA-luc与pRLSV40-N质粒混合，并用Lipofectamine 3000封装；同时将si-STAT3或si-RNA阴性对照（NC）分别用Lipofectamine 3000封装，按实验分组处理细胞，使细胞转染入目的质粒和siRNA片段；正常培养48 h后，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，按说明书操作，裂解细胞后，利用多功能酶标仪自动加入底物后测定每孔的相对荧光信号（RLU），其中，先加入并测量萤火虫荧光素酶的底物及活性，间隔5 s后，加入并测量海肾荧光素酶，按下列公式计算：

在观察LIF过表达对子宫内膜癌细胞体外生物学影响的实验中，载有LIF编码基因的慢病毒感染细胞（HEC-1B、RL95-2）为实验组，缩写LIF组，对照组为空载体慢病毒感染细胞，缩写Vector组；在过表达LIF的两子宫内膜癌细胞中沉默STAT3的介导实验中，转染针对STAT3的siRNA片段为实验组，缩写siSTAT3组，转染无意序列的siRNA片段为对照组，缩写NC组。每次进行统计分析的实验设3复孔，且重复3次以上；数据处理分析使用Excel 2016、GraphPad7.0、SPSS 21和Illustrator CS6软件；重复试验的计量资料用均数±标准差表示，两组间采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析，其中组间两两比较采用Tukey检验，检验水准α=0.05。

RT real-time PCR实验显示，过表达模型的两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）中LIF的mRNA水平显著上升（P < 0.05，图 1A），ELISA实验显示，过表达模型的两子宫内膜癌细胞能在24 h内分泌更多的LIF（P < 0.05，图 1B）。

图 1(Fig.1)

图 1 过表达LIF子宫内膜癌细胞建立 Fig.1 Overexpression of LIF in endometrial cancer cells. A: Real-time PCR analysis; B: ELISA analysis (n=3, *P < 0.05 vs vector).

CCK-8实验显示，在两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）细胞中过表达LIF，24 h后相对吸光度分别为2.26±0.31和2.94±0.29，对照组为2.33±0.24和2.51± 0.40，两组间差异无统计学意义（P>0.05）；48 h后相对吸光度分别为4.38±0.55和5.26±0.56，对照组为4.09± 0.51和5.07±0.78，两组间差异无统计学意义（P>0.05）；72 h后相对吸光度分别为9.02±0.52和9.07±0.87，对照组为8.65±0.95和8.70±0.82，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。

细胞凋亡分析显示，过表达LIF能增加两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）在顺铂及紫杉醇作用下的存活率（图 2），与对照组相比，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

图 2(Fig.2)

图 2 过表达LIF对化疗药物杀伤癌细胞能力的影响 Fig.2 Effect of LIF overexpression on cisplatin-or paclitaxel-induced apoptosis of the cells (n=3, *P < 0.05 vs vector).

线粒体膜电位分析分析显示，过表达LIF能增加两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）在顺铂及紫杉醇作用下的线粒体膜电位（图 3），与对照组相比，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

图 3(Fig.3)

图 3 过表达LIF对化疗药物破坏癌细胞线粒体膜电位的影响 Fig.3 Effect of cisplatin or paclitaxel on mitochondrial membrane potential in the LIF-overexpressing cells (n=3, *P < 0.05 vs vector).

免疫印迹显示，过表达LIF能增加两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）中Bcl-2、Bcl-xL和p-STAT3的水平，降低Bax和Bad的水平，而不影响STAT3的水平（图 4）。

图 4(Fig.4)

图 4 过表达LIF对Bcl-2家族及STAT3通路蛋白表达水平的影响 Fig.4 Western blot analysis of expressions of Bcl-2 family proteins and STAT3 pathway related proteins in LIF-overexpressing cells. *P < 0.05 vs vector.

双荧光素酶报告基因实验显示，过表达LIF能增加两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）中pSTAT3-TA-luc的报告基因活性，但不影响pGL6-TA-luc的活性（图 5）。

图 5(Fig.5)

图 5 过表达LIF对STAT3转录活性的影响 Fig.5 Effect of LIF overexpression on STAT3 transcriptional activity in the cells (n=3, *P < 0.05 vs vector).

免疫印迹显示，在稳定表达LIF的两子宫内膜癌细胞（HEC-1B、RL95-2）中转染针对STAT3的小干扰RNA，能抑制STAT3及p-STAT3蛋白水平（图 6A）。细胞凋亡分析显示，在稳定表达LIF的两子宫内膜癌细胞中，沉默STAT3能显著增加顺铂及紫杉醇对细胞的杀伤作用（图 6B，P < 0.05）。

图 6(Fig.6)

图 6 沉默STAT3能部分逆转过表达LIF增强的化疗抵抗 Fig.6 Effect of STAT3 silencing on apoptosis induced by cisplatin or paclitaxel in LIF-overexpressing cells.A: Western blotting; B: STAT3 transcriptional activity (n=3, *P < 0.05 vs NC).

本文研究发现，稳定高表达LIF能增强宫内膜癌细胞对顺铂及紫杉醇的抵抗，其机制可能是LIF能激活STAT3信号通路，上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，下调诱导凋亡蛋白Bad和Bax，进而保护了线粒体的功能，降低了细胞凋亡比例。功能性的LIF是一种分泌型糖蛋白，最早因其能抑制髓样白血病M1细胞的增殖和促进其分化而得名^[18]，早期研究认为，人和小鼠LIF基因分别定位于第22号和第11号染色体，基因全长分别为6.0 kb和6.3 kb，均含有3个外显子和2个内含子，编码区内碱基保守性较高，其他哺乳类动物与人类基因组的同源性在78~94%^[19]；最近的研究显示，LIF存在多个可能存在的可变剪切体，且功能可能有一定的区别^[20]，而在实体瘤中，LIF还是主要以功能性细胞因子起促进肿瘤的恶性进展及放化疗抵抗^[21-25]。因此，本文选用了LIF最常见，也是编码分泌型细胞因子的转录本NM_002309为研究对象，在Yu等^[26]的研究中，利用逆转录病毒构建的稳定高表达LIF的结直肠癌细胞，能增加细胞分泌的LIF，激活STAT3信号通路，下调p53蛋白水平增强化疗药物对癌细胞的杀伤作用，支持了本文所构建的体外过表达LIF细胞模型的意义。

本课题组前期利用CNV分析方法，从癌症基因组图谱（TCGA, https://gdc-portal.nci.nih.gov/）数据库中，筛选22q12.2区段的扩增可能与患者化疗的抵抗相关，其中LIF为22q12.2区段的扩增热点，其拷贝数增加与患者化疗的抵抗相关^[9]。然而本团队无法短时间内收集到足够的符合要求的临床标本，暂时无法利用我国人群数据，验证LIF扩增及表达情况与患者化疗反应的相关性。因此，本文采用了慢病毒将LIF编码框区域，整合进两子宫内膜癌细胞基因组中，模拟LIF的扩增，系列的体外功能实验证明，LIF扩增导致的LIF分泌增多，并不显著影响子宫内膜癌细胞的增殖活性，但能促进癌细胞在体外环境下对化疗药物的耐受。虽然未见关于LIF在基因组上的扩增与肿瘤化疗抵抗的相关报道，但是已有研究发现^[27]，胆管癌中存在LIF基因所在区段（22q12.2）的扩增，并与组织中LIF的免疫组化染色强度相关，且22q12.2区段的扩增与胆管癌患者更早的复发转移相关，进一步支持了本文探索LIF扩增及过表达导致子宫内膜癌细胞化疗耐受的意义。

LIF的受体为白血病抑制因子受体（LIFR），Shi等^[23]指出，在胰腺癌动物模型上，中和环境中的LIF或敲除癌细胞的LIFR，均能显著抑制胰腺癌的恶性进展，增强化疗药物的有效性，延长动物的生存时间；其机制可能与LIF能通过LIFR增强STAT3的磷酸化水平及转录水平，进而调控与疾病进展及化疗抵抗相关的基因表达。本文的研究结果同样显示，即使顺铂和紫杉醇的抗癌机制各异，但都能观察到对线粒体功能的破坏并诱导细胞发生凋亡，而过表达LIF能激活STAT3信号通路，上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，下调诱导凋亡蛋白Bad和Bax，稳定线粒体膜电位并减少细胞的凋亡；结合上述研究^[21-25]，可以明确LIF参与了多种肿瘤的恶性进展与化疗抵抗，是潜在的治疗靶点。值得我们注意的是，正常的子宫内膜腺上皮合成并分泌LIF，呈月经周期依赖性，是启动胚泡着床及维持胚胎早期发育的关键^[28-30]，而LIF在增生性子宫内膜及内膜癌中表达上调，并可能参与了子宫内膜癌的恶性进展^[21]，因此，进一步探讨LIF在女性生殖系统及胚胎形成与发育中的作用，或许能避免抗LIF疗法带来潜在的风险。

此外，Shi等^[23]的研究还指出，组织中LIF和血浆中LIF的含量水平，可以作为反映胰腺癌进展情况及治疗反应的标志物；而胰腺癌组织中的LIF主要由胰腺星形细胞，并通过旁分泌的机制作用于胰腺癌细胞。是否在子宫内膜癌中，微环境中LIF主要是肿瘤细胞相关区段扩增导致，而不是间质细胞分泌？探索这个问题将是我们后续研究的重点；而本文通过系列实验初步证明，在体外环境中，稳定高表达LIF能增强宫内膜癌细胞对顺铂及紫杉醇的抵抗。