2019, Vol. 39
2. 重庆市生物医学工程学重点实验室，重庆 400016
2. Chongqing Key Laboratory of Biomedical Engineering, Chongqing 400016, China
外阴慢性单纯性苔藓（LSC）属于外阴色素减退性疾病，是外阴瘙痒最常见的原因之一，好发于中老年妇女，其发病率至今尚不明确[1-4]。其病理特征为外阴皮肤表层鳞状上皮增生，细胞过度角化或角化不全，真皮浅层胶原纤维化伴有不等量炎细胞浸润[5-6]。临床各种治疗外阴LSC方法均有其局限性，复发率较高[7-8]，而聚焦超声治疗外阴LSC效果显著，复发率极低[9]，但关于聚焦超声降低外阴LSC的复发率机制的研究尚未见报道。本实验通过研究notch1及c-fos蛋白聚焦超声治疗前后在SD大鼠外阴LSC模型外阴皮肤组织中的变化，探寻聚焦超声通过抑制SD大鼠外阴LSC模型真皮浅层胶原纤维化，从而降低外阴LSC复发率的机制。
外阴LSC真皮浅层胶原纤维化，其真皮层成纤维细胞增多，胶原纤维过度沉积的病理改变与瘢痕疙瘩类似[10]，因此猜想外阴LSC因具有瘢痕疙瘩纤维化的特性，而导致疾病易反复发作、不易根治，针对这种纤维化的特性进行动物实验设计，探究聚焦超声通过抑制其外阴皮肤组织纤维化，降低外阴LSC复发率的机制。有文献通过建立SD大鼠外阴LSC模型对聚焦超声缓解外阴LSC的瘙痒症状进行研究[11]，但尚未有学者研究聚焦超声降低外阴LSC复发率的机制。本实验采用二甲基苯并蒽（7, 12-DMBA）溶液涂抹于健康SD大鼠外阴数周诱导出SD大鼠外阴LSC模型[11-12]，然后进行聚焦超声治疗，观察聚焦超声对SD大鼠的治疗效果，治疗前后大鼠外阴组织中notch1和c-fos的变化以及真皮浅层胶原纤维化的程度，研究聚焦超声降低外阴LSC复发率的机制。
1 材料和方法 1.1 实验动物健康雌性SD大鼠60只，体质量160~180 g，6~8周龄，由重庆医科大学实验动物中心提供[动物使用许可证号：SYXK（渝）2018-0003]，所有动物实验已经重庆医科大学伦理委员会批准。
1.2 试剂及仪器二甲基苯并蒽（美国Sigma）；分析纯丙酮溶液（上海阿拉丁）；masson三色染色液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司）；notch1单克隆抗体、c-fos单克隆抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥）。海极星®CZF型超声波妇科治疗仪（重庆海扶医疗科技股份有限公司）。
1.3 实验方法 1.3.1 动物模型的建立及分组将60只雌性SD大鼠备皮消毒后，硬毛牙刷刷大鼠外阴皮肤，刷至皮肤充血发红即可。用勾线笔蘸0.5% DMBA丙酮溶液涂布于外阴皮肤。每周一、三、五3次涂药，连续12周。外阴活检确定模型建立成功[11]的50只雌性SD大鼠，按随机数字表随机分为治疗组和对照组（n=25）。
1.3.2 聚焦超声治疗治疗组：1.0%戊巴比妥钠腹腔麻醉SD大鼠后，备皮消毒，治疗区域涂超声治疗专用耦合剂。CZF治疗参数：频率10.02 MHz；脉冲1000 Hz；焦距3.5 mm；功率2.8 W；根据皮损的范围、程度和局部对超声辐照的反应确定辐照时间，一般69±18.855 s；均采用单次治疗的方式，治疗剂量为193.2±53.795 J。治疗头紧贴大鼠外阴皮肤，辐照方式为匀速直线辐照，速度为5~10 mm/s。TES-1310测温仪测量外阴皮肤温度，当温度达到40~43 ℃ [13]时停止辐照。对照组：治疗过程与治疗组相同，但仪器无功率输出。
1.3.3 肉眼及病理观察每次实验前对全部SD大鼠进行称重和观察及触诊大鼠全身是否有肿块，淋巴结是否肿大。对照组观察DMBA涂抹后外阴皮肤是否有充血；触摸时皮肤是否有紧绷和增厚感，皮肤弹性是否减弱；药物涂抹一段时间后皮肤表面是否有肿瘤样新生物生长等变化。治疗组肉眼观察聚焦超声治疗后第1、4、7、14、21天外阴皮肤是否有水肿溃疡，皮下硬结，瘢痕增生等变化。在治疗4周取外阴皮肤活检进行组织学观察，对照组也同时活检，取下的皮肤组织由4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色和masson染色。
1.3.4 胶原纤维密度取活检确定为LSC和聚焦超声治疗后4周的大鼠皮肤组织石腊块，脱蜡、水化组织切片；切片入重铬酸钾浸泡过夜，自来水冲洗；铁苏木素A液与B液等比混合成铁苏木素染液染色；丽春红酸性品红染色、磷钼酸染色后经甲苯胺蓝染色；1%冰醋酸分化后透明封片。masson染色后真皮层胶原纤维呈蓝色，采用IPP 6.0软件对切片的染色信号进行光密度分析，平均光密度值代表真皮层胶原纤维的平均密度。每张切片在高倍镜（×400）下随机选取5个视野，计算其平均光密度值。
1.3.5 透射电镜观察取活检确定为LSC和聚焦超声治疗后4周的大鼠外阴皮肤组织，0.9%生理盐水清洗干净至组织块表面无血迹，置4%戊二醛液（pH 7.4）、4 ℃冰箱冷藏预固定2 h以上，再用1%四氧化锇后固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，经半薄切片光镜下定位表皮及真皮组织，进行超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色后Hitachi-7500型透射电镜观察、拍照。
1.3.6 免疫组织化学取活检确定为LSC和聚焦超声治疗后4周的大鼠皮肤组织石腊块，脱蜡、水化组织切片；组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（pH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复；3% H2O2去离子水室温避光孵育25 min，在PBS（pH7.4）溶液中洗涤3次，每次5 min；3%BSA室温封闭30 min，滴加相应的按一定比例与PBS配比的一抗，4 ℃孵育过夜；滴加相应的二抗，PBS冲洗3次，DAB显色液显色，复染、脱水封片。在高倍显微镜（×400）下观察，notch1以细胞膜和/或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，c-fos以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，采取到的图像采用软件IPP6.0进行光密度分析，平均光密度值代表蛋白表达的强度，每张切片随机选取5个视野，计算平均光密度值。
1.3.7 Western blot检测取保存于-80 ℃的活检确定为LSC的外阴皮肤组织，组织研磨后加入匀浆液（每60 mg组织加入200 μL匀浆液）提取皮肤组织细胞浆或细胞核蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。蛋白样品在SDS-聚丙烯酰氨凝胶中电泳分离后采用湿转法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上（300 mA，30 min），5%脱脂牛奶（0.5% TBST配）于室温下封闭4 h，先后加入一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA）和相对应的二抗（TBST稀释比例1:3000），最后经化学发光法显像。图像结果采用凝胶成像系统进行图象分析，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
1.4 统计学分析应用SPSS22.0统计软件进行分析处理。样本量的估算采用完全随机设计的两个总体率假设检验。治疗后治愈率的比较采用连续校正χ2检验。计量资料用均数±标准差表示，本实验采用Shapiro-Wilk检验法进行数据的正态性检验，符合正态性、方差齐性，因此采用两独立样本t检验，P < 0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 外阴皮肤形态及病理观察对照组SD大鼠（聚焦超声治疗前）肉眼观外阴皮肤表面基本无毛发生长，弹性差，有紧绷和增厚感，表面较粗糙，增厚明显的部位有发红现象（图 1A）。治疗组聚焦超声辐照后第1天，SD大鼠外阴皮肤表皮完好，有轻度充血水肿现象。第4天SD大鼠充血水肿消退，有轻度结痂现象。第7天SD大鼠外阴仍然存在轻度结痂现象。第14天SD大鼠外阴结痂脱落，外阴皮肤基本恢复正常。第21天SD大鼠外阴有毛发生长，触之弹性较好，皮肤功能基本恢复正常（图 1B）。
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图 1 SD大鼠外阴皮肤形态学和病理学 Fig.1 Morphology and pathology of SD rat genital skin. A: Genital skin of a rat with vulvar lichen simplex chronicus (LSC) showing reddened skin indicating hyperplasia (arrow); B: Genital skin of a rat after focus ultrasound therapy; C, D: pathological examination of the skin tissue of rats with vulvar LSC and after focus ultrasound therapy (HE staining, original magnification: ×100). |
病理检查结果显示，对照组SD大鼠外阴皮肤表皮复层鳞状上皮增生，主要为棘细胞层增生，表皮过度角化或角化不全，真皮层胶原纤维过度增生和沉积，胶原纤维均质化，伴炎细胞浸润（图 1C）。治疗组聚焦超声辐照后第1天, 真皮乳头层水肿；第4天水肿消退, 有慢性炎性细胞浸润；第7天真皮层可见新生毛细血管增生；第14天真皮层胶原纤维数量减少；第21天SD大鼠外阴皮肤表皮增生较聚焦超声治疗前减弱，真皮层胶原纤维密度较治疗前减小，排列疏松（图 1D）。
2.2 病理学结果统计聚焦超声治疗4周后，对照组中有19只（76%）大鼠继续进展为外阴低级别鳞状上皮内病变（LSIL），3只（12%）仍然表现为LSC，3只（12%）恢复正常。经过聚焦超声干预的治疗组大鼠中，16%（4/25）大鼠继续进展为LSIL，4%（1/25）大鼠仍为LSC，80% (20/25)实验大鼠外阴皮肤恢复正常（表 1），两组治愈率差异有统计学意义（χ2=20.620，P < 0.05）。
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表 1 各组病理学改变 Tab.1 Pathological changes in each group |
对照组SD大鼠经过masson染色观察，在表皮基底层与真皮交界的部位胶原纤维过度增生和沉积，蓝染部位密度明显增大（图 2A），经检测光密度值为0.2077± 0.0205。治疗组的SD大鼠在治疗后真皮浅层胶原纤维蓝染部位密度明显减小（图 2B），经检测光密度值为0.1287±0.0165，两组差异具有统计学意义（P < 0.05）。
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图 2 真皮浅层胶原纤维masson染色 Fig.2 Masson staining showing the superfical collagen fiber (×200). A: Control group; B: Treatment group. |
对照组SD大鼠透射电镜观察到表皮层棘细胞层细胞数量增多，可见大量淋巴细胞浸润，线粒体肿胀。真皮层可见致密的平行或交错分布的胶原纤维束，成纤维细胞内粗面内质网明显。表皮与真皮交界处可见淋巴细胞浸润，偶有水肿现象，可见肥大细胞的脱颗粒现象（图 3A）。治疗组的SD大鼠外阴皮肤表皮层结构与正常SD大鼠无异，棘细胞层仅有轻微增生现象。真皮层胶原纤维密度明显减小，可见成纤维细胞和纤维细胞。表皮与真皮交界处可见少量淋巴细胞浸润（图 3B）。
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图 3 真皮浅层透射电镜观察 Fig.3 Transmission electron microscopy of the superficial dermis (× 8000). A: Transmission electron microscopy in the control group showing dense parallel or staggered collagen fiber bundles, and rough endoplasmic reticulum in fibroblasts is clearly visible (arrow); B: Transmission electron microscopy in the treatment group showing obviously lowered density of collagen fibers in the superficial dermis, and the epithelial basal cells are visible. |
对照组SD大鼠外阴皮肤中notch1和c-fos表达较多，呈棕黄色颗粒，着色较深，notch1的阳性表达部位主要位于表皮层胞质内，c-fos的阳性表达部位主要位于表皮层胞核内，二者均呈强阳性表达，真皮层仅有少量表达（图 4A、C）。治疗组仅有少量表达，且着色较浅，呈弱阳性或者阴性，阳性细胞数量明显较少（图 4B、D）。与对照组相比，治疗组notch1表达量明显降低（t=15.573，P < 0.05）；治疗组c-fos的表达量也明显降低（t=19.996，P < 0.05，表 2）。
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图 4 免疫组织化学检测notch1和c-fos蛋白在SD大鼠外阴皮肤中的表达 Fig.4 Expression of notch1 and c-fos proteins in the vulvar skin of SD rats detected by immunohistochemistry (× 400). A: Strong Notch1 protein expression in the vulvar skin of a control rat, locating mainly in the cytoplasm (arrow); B: Relatively weak Notch1 expression (arrow) and significantly decreased positive cells in a rat in the treatment group; C: Strong C-fos protein expression in the vulvar skin of a control rat, located mainly in the cell nuclei (arrow); D: Lowered C-fos expression (arrow) and decreased number of positive cells in the treatment group. |
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表 2 SD大鼠外阴组织皮肤中notch1和c-fos蛋白的相对表达量 Tab.2 Relative expression of notch1 and c-fos protein in the genital skin of SD rats (Mean±SD) |
治疗组notch1、c-fos的条带明显比对照组细（图 5A、B），治疗组大鼠外阴皮肤组织中notch1、c-fos蛋白的相对表达量明显降低，两组差异具有统计学意义（P < 0.05，表 2）。
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图 5 Western blot检测大鼠外阴皮肤中notch1、c-fos蛋白的表达 Fig.5 Expression of notch1 and c-fos proteins in the vulvar skin of the rats detected by Western blotting. A: Notch1 protein expression; B: C-fos protein expression; 1: control group; 2: Treatment group. |
外阴LSC可能主要继发于各种慢性刺激导致外阴顽固性瘙痒的疾病[14-15]。聚焦超声治疗外阴LSC有效性高，安全性好，具有明显的高效治疗和低复发率的优势，目前在我国已广泛用于治疗外阴上皮内非瘤样病变[9, 16-17]。外阴LSC真皮层胶原纤维化，其真皮层成纤维细胞增多，胶原纤维过度增生和沉积的病理改变与瘢痕疙瘩类似[18-19]。因外阴LSC瘙痒所致的外阴瘢痕性增生具有瘢痕疙瘩的特性，易反复发作、不易根治、瘙痒难忍等[20-21]。针对这种纤维化特性，本实验通过建立SD大鼠外阴LSC模型，探寻聚焦超声通过抑制SD大鼠外阴LSC模型外阴皮肤组织中notch1及c-fos的表达，从而抑制SD大鼠外阴LSC模型真皮浅层胶原纤维化，降低外阴LSC复发率的机制。notch1和c-fos蛋白均参与和控制真皮层胶原纤维化的相关过程。notch1蛋白存在于角质形成细胞表面的配体，通过notch1信号途径促进真皮成纤维细胞胶原蛋白的释放和纤维化[22]。c-fos可被角质形成细胞释放的KDAF蛋白激活，导致真皮层成纤维细胞中的MMP-1mRNA过表达，从而影响成纤维细胞分化增殖或者转化、胶原合成与降解的过程[23-25]。
在本研究中，模型建立成功的SD大鼠，即对照组SD大鼠的外阴皮肤组织表皮层，经过免疫组织化学检测和Western blot检测后可知，notch1和c-fos蛋白表达明显增加。免疫组织化学检测后高倍显微镜下观察对照组SD大鼠外阴皮肤组织，被染为棕黄色的细胞颗粒较多，蛋白表达具有明显阳性。Western blot检测后观察对照组SD大鼠外阴条带明显粗于治疗组，结果表明对照组SD大鼠蛋白表达较多。本研究对照组SD大鼠经过maason染色后可知真皮浅层胶原纤维化明显，表现为成纤维细胞增多，透射电镜观察可见明显的粗面内质网，粗面内质网增多，结果表明胶原蛋白分泌活跃，因此导致胶原蛋白过度沉积，真皮层胶原纤维密度增大；而聚焦超声治疗后的SD大鼠经过maason染色后真皮浅层胶原纤维细胞较治疗前密度明显减少，排列疏松，电镜下观察成纤维细胞和纤维细胞偶见。同时，治疗组通过免疫组织化学和Western blot检测可知，与纤维化相关的蛋白notch1及c-fos蛋白的表达均减少，表现为细胞黄染颗粒较少，染色较浅，Western blot条带较细，蛋白表达量较少；该结果表明表皮层与纤维化相关的蛋白表达被抑制，表明聚焦超声治疗可以通过表皮层notch1及c-fos蛋白抑制真皮层两种蛋白纤维化相关的通路，从而抑制SD大鼠外阴LSC外阴皮肤组织纤维化，降低LSC的复发率。临床治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩手段繁多[26-28]，但各种治疗方式均有其局限性，聚焦超声应用于瘢痕疙瘩治疗可发挥其无辐射等优势。
总之，聚焦超声治疗可以降低LSC患者术后的复发率，动物模型的研究也证实了外阴LSC经聚焦超声治疗后真皮浅层胶原纤维化程度减弱，其恢复程度接近于正常皮肤组织，与纤维化相关的蛋白如notch1和c-fos蛋白的表达降低也可能与聚焦超声治疗有关。探寻聚焦超声治疗减低外阴LSC的复发率机制，有利于临床进一步研究外阴LSC的发病机制，为临床彻底治愈外阴LSC的探索提供理论依据。
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