辅助生殖技术（ART）是现代医学治疗不孕症的主要手段^[1]，其中控制性促排卵（COH）是ART治疗的核心步骤。尽管目前妊娠率达到50%~60%，但仍未达到满意程度，其中能否获得数量适中的优质卵子是提高周期妊娠率的关键。卵泡的微环境与卵子的生长发育及胚胎质量密切相关。研究表明^[2-3]卵泡液中晚期糖基化终产物（AGEs）的蓄积影响卵巢的反应性及胚胎质量。可溶性AGE受体（sRAGE）为RAGE的胞外段，因其能够与AGEs结合阻碍AGEs与RAGE结合行使生物功能，通常被认为是体内的“优质”受体^[4-6]。AGEs-RAGE在整体及卵巢局部的高表达以及sRAGE表达下降与女性不孕及不良妊娠结局关系密切^[7-8]。

文献报道多囊卵巢综合征（PCOS）妇女本身血清、卵泡液以及组织中有异常升高的AGEs水平^[9-11], 并在促排卵周期中卵泡液中AGEs-RAGE的水平亦明显升高，但用AGEs-RAGE的水平反应多囊卵巢综合征患者在促排卵周期中与临床数据的相关性难以做到客观体现。非多囊卵巢患者COH后卵泡液sRAGE水平是否可以预测卵巢反应性暂无文献报道。本研究以非多囊卵巢综合症患者为研究对象，分析其COH后卵泡液sRAGE水平与其卵巢反应性的相关性。以期为临床非多囊卵巢患者预测女性卵巢反应，为改善卵巢反应不良、胚胎质量不优患者提供依据和预测，为临床控制性促排卵的有效性提供一定的理论基础。

选取在南京总医院生殖医学中心自2015年2月~ 2016年12月接IVF/ICSI治疗的90例患者。这项研究得到南京军区总医院伦理委员会的批准（编号2015nzky-003-01），所有参与者都得到知情同意。

包括以下不孕因素的的妇女：卵巢储备功能正常者、输卵管因素不孕者、特发性不孕者、男性因素或双方因素不孕者。

排除以下因素的不孕妇女：多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症患者，患有心脏、肝脏、肾脏以及血管病变患者，以及伴有其他未治疗或未纠正的内分泌疾病。

月经周期第3天阴道B超检查计数基础窦卵泡数目（AFC），检测基础性激素水平，并测量体质量指数（BMI），收集ART治疗周期中获卵数、卵裂率以及优胚率等数据。

采用常规长方案：于治疗前一周期的黄体中期，给予达菲林（GnRH-a）降调节。下一周期月经2~4 d检测患者血清E₂、LH，阴道B超探查子宫内膜厚度。如果子宫内膜厚度 < 5 mm、血LH < 5 U/L及E₂ < 183.5 pmol/L，提示降调节达标，给予外源性促性腺激素（Gn）开始促排卵治疗。根据患者年龄、AMH、BMI、AFC计数情况给予果纳芬125~200 u启动。待阴道超声监测提示，双侧卵巢主导卵泡直径均达到18 mm以上时，停止Gn注射，给予HCG5000-10 000 U肌注，36 h后行阴道B超引导下穿刺取卵术。取卵后将卵泡液中的卵-冠-丘复合体转入培养皿中，经过卵母细胞成熟度分型与受精前预培养、精液处理、精卵混合培养，于受精后12~14 h评估受精情况，受精后24 h评估受精卵的卵裂情况及胚胎质量评分。

取卵日，收集穿刺卵泡直径在14 mm以上的卵泡液，置于干燥管中，2500 r/min离心10 min，取上清分装于1.5 mL离心管中，-80 ℃冻存待测。采用ELISA法分别测定卵泡液中sRAGE浓度。

联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉华美）。用酶联免疫吸附法测定卵泡液中的sRAGE水平。根据试剂盒检测标准操作，内、间检测系数分别为9.9%和10.9%。操作步骤：将卵泡液解冻后再次离心待检测，检测试剂按试剂盒说明配置；每孔加样100 μL，轻轻晃动混匀，37 ℃温育2 h；加生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃温育1 h；洗板；加辣根过氧化物酶标记亲和工作液100 μL，37 ℃温育1 h；洗板；加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15~30 min；加终止液50 μL，终止反应；酶标仪在450 nm波长测量各孔光密度。

采用SAS统计软件进行统计分析，对计量资料以均数±标准差表示，对两组数据的比较采用t检验分析，对数据的相关性分析用Spearman, s test分析，对三组间数据的比较采用单因素方差分析，对组间率的比较采用卡方检验或Fisher检验，P < 0.05表明组间有统计学差异。

纳入患者共90例，其中IVF73例，ICSI17例。病因构成为输卵管因素占61.2%，排卵障碍因素占4.4%，男性因素占27.8%，特发性不孕占4.4%，双方因素2.2%。在不同病因中，各组之间的基础激素状态、促排周期激素水平、获卵数和胚胎情况等临床特点无统计学差异（P > 0.05，表 1）。

表 1(Tab.1)

表 1 患者临床特点和促排周期中的检测指标情况 Tab.1 Clinical characteristics of the participants undergoing controlled hyperstimulation (n=90) Variables Values Age (years) 30.47±4.45 BMI (kg/m2) 23.00±3.07 AFC 18.19±8.09 AMH (D3) (ng/mL) 3.84±2.48 FSH (D3) (U/L) 7.03±2.27 T (D3) (nmol/L) 1.25±0.43 LH (D3) (U/L) 5.29±2.67 E2 (D3) (pmol/L) 165.52±95.99 Total Gonadotrophin (U) 1714.86±693.05 HCG日FSH (U/L) 13.74±6.02 HCG日E2 (pmol/L) 15703.48±6851.12 Number of MII oocytes retrieved 12.86±6.82 Fertilization rate (%) 73.62±18.60 Rate of high-quality embryos (%) 38.92±23.48 sRAGE (ng/mL) 656.99±281.90 AFC: Antral follicle count; sRAGE: Soluble Receptor For Advanced Glycation End Product, sRAGE; AMH: Anti-Mullerian hormone; BMI: Body mass index; HCG: Human chorionic gonadotrophin.

表 1 患者临床特点和促排周期中的检测指标情况 Tab.1 Clinical characteristics of the participants undergoing controlled hyperstimulation (n=90)

表 2(Tab.2)

表 2 卵泡液sRAGE水平与成熟卵数目的相关性 Tab.2 Association between the level of sRAGE in follicular fluid and the number of MII oocytes retrieved (n=90) Variable r P Age (years) -0.24 0.02 BMI (kg/m2) -0.09 0.37 AFC 0.51 < 0.0001 FSH (D3) (U/L) -0.30 0.0036 E2 (D3) (pmol/L) 0.01 0.95 Gn (U) -0.57 < 0.0001 HCG日FSH (U/L) -0.46 < 0.0001 HCG日E2 (pmol/L) 0.63 < 0.0001 AMH (ng/mL) 0.64 < 0.0001 Number of MII oocytes retrieved 0.77 < 0.0001 Fertilization rate (%) 0.30 0.0047 Rate of high-quality embryos (%) 0.20 0.055

表 2 卵泡液sRAGE水平与成熟卵数目的相关性 Tab.2 Association between the level of sRAGE in follicular fluid and the number of MII oocytes retrieved (n=90)

卵泡液的sRAGE水平与年龄（P=0.02）、基础FSH（P=0.0036）和Gn使用量（P < 0.0001）呈显著负相关关系；卵泡液的sRAGE水平与AFC（P < 0.0001）、获卵数（P < 0.0001），受精率（P=0.0047）呈显著正相关关系。卵泡液的sRAGE水平能反映卵巢储备功能以及促排后的卵巢反应性。

目前公认在COH中获卵数在7-15对获得好的临床结局是适宜的。本研究将根据获卵数目进行分组：在目标获卵数目以下（小于7个）。在目标标获卵数范围内（7-15），在目标获卵数目以上（> 15个），进行分层数据分析。

按照获卵数目进行分层分析，发现卵泡液的sRAGE水平与AFC、基础FSH、AMH的趋势吻合。在目标获卵数目以上组明显高于目标获卵数组和目标获卵数目以下组（P值分别为：P < 0.0001和P=0.0012）；卵泡液的sRAGE水平与AFC进行组间比较，目标获卵数目以下组与目标获卵数目组和目标获卵数目以上组呈明显正相关（P值分别为：P=0.0008和P < 0.0001）；卵泡液的sRAGE水平与D₃血清FSH水平进行组间比较，目标获卵数目以下组与目标获卵数目组和目标获卵数目以上组呈明显负相关（P值分别为：P=0.0002和P < 0.0001）；卵泡液的sRAGE水平与AMH水平进行组间比较，目标获卵数目以下组与目标获卵数目组和目标获卵数目以上组呈明显正相关（P值分别为：P=0.0004和P < 0.0001）。

卵泡液的sRAGE水平与Gn用量和获卵数呈显著相关性反映了促排卵治疗中的卵巢反应性。卵泡液的sRAGE水平与受精率方面有明显正相关关系。卵泡液的sRAGE水平与HCG日血清E₂水平进行组间比较，三组之间有明显正相关（P值分别为：P=0.0001，P < 0.0001，P=0.0001）；卵泡液的sRAGE水平与Gn用量水平进行组间比较，目标获卵数目以下组与目标获卵数目以上组呈明显负相关（P < 0.0001）；卵泡液的sRAGE水平与获卵数进行组间比较，三组之间有明显正相关（P值均 < 0.0001）；卵泡液的sRAGE水平与受精率进行组间比较，三组之间有明显正相关（P值分别为：P=0.0011，P < 0.0001，P= 0.0002）。

在ART治疗中，卵巢功能直接影响临床获卵数及后续妊娠结局^[12]。在促排之前需要评估卵巢功能选择适宜的促排方案。AMH是目前公认的育龄期妇女卵巢储备功能的标记物，具有极高的灵敏度和特异性^[13-14]，通过从外周血检测的间接反映指标。本研究利用取卵手术中获取的卵泡液，进行检测卵泡液中sRAGE表达，结果提示卵泡液中sRAGE表达可以反映卵巢的反应性，可以用于评估卵巢功能，并与常规评估卵巢功能的指标：年龄、AFC、基础FSH具有一致性^[15]。文献报道^[16-17] AGEs-RAGE系统与卵巢功能相关，随年龄增加机体会有AGEs积蓄现象并能影响细胞凋亡的发生^[18-19]；卵泡液中sRAGE蛋白含量可能影响AMH的分泌并与AMH蛋白含量正相关，能够反映育龄期妇女的卵巢储备能力^[20-21]。本研究结果亦支持文献报道的机制机理，为临床评估卵巢功能预测促排后卵巢反应性提供了可靠、直接、简便的检测指标；为临床选择合适的促排方案起到了有益的指导作用。

sRAGE作为卵泡微环境中的分泌因子，可以直观地反映非多囊卵巢患者COH后的卵巢反应性。本研究结果显示卵泡液中sRAGE表达与获卵数（P < 0.0001），受精率（P=0.0047）呈显著正相关关系。对ART治疗的妊娠结局具有非常重要的评估价值，并可以指导后续卵子体外受精和胚胎培养方案，优化和改善卵子利用率，可有效地改善临床妊娠结局。

文献报道PCOS患者血清和卵泡液中sRAGE水平明显低于正常对照组^[22]。卵泡液中sRAGE水平可反映COH后获卵数与受精率情况，并能预测在COH中的卵巢反应性。其机制可能有两个方面：第一方面，sRAGE在AGEs-RAGE系统中所发挥的作用：（1）卵巢微环境的AGEs的积累对卵泡生长、胚胎发育均有负面影响^[23]，卵泡液AGEs的积累可导致卵巢功能障碍和不良的IVF结局。sRAGE作为RAGE的可溶性形式，可以作为诱饵，抑制AGEs-RAGE在体内产生的不良影响。（2）AGEs-RAGE系统可激活MAP激酶和NF-κB，促进促炎状态和活性氧生成（ROS）^[24-27]。sRAGE与AGEs结合，有效地抑制NF- κB的激活从而降低其在体内产生的不良影响。（3）sRAGE可能通过调控卵泡膜层微血管网的形成进而调节卵泡的发育和成熟。卵巢内新生血管的形成在女性生殖系统中发挥着重要的作用能够影响卵巢周期性变化、卵泡发育和黄体形成等^[28]。sRAGE可以清除循环中的AGEs, 改善卵子生长的微环境。第二方面，sRAGE可能通过VEGF表达一方面通过调控卵泡膜层的微血管网形成、增加血管通透性调控卵泡发育，抑制卵泡闭锁^[29]；另一方面，能直接作用于卵泡，促进细胞增殖及卵母细胞成熟^[30]。

表 3(Tab.3)

表 3 卵泡液sRAGE水平在三个不同反应亚组间的分析 Tab.3 Analysis of sRAGE levels in follicular fluid among 3 different subgroups Variable Below target response < 7oocytes (n=21) Within target response 7~15 oocytes (n=42) Above target response > 15 oocytes (n=27) Age (years) 31.90±4.38 30.57±4.33 29.19±4.72 BMI (kg/m2) 22.76±3.02 23.18±3.35 22.91±2.74 AFC 11.38±4.49 18.45±7.23a 23.07±7.99b, c FSH (D3) (U/L) 8.43±2.75 6.77±1.96a 6.34±1.88b E2 (D3) (pmol/L) 185.10±121.59 144.17±75.81 183.52±98.62 LH (D3) (U/L) 5.79±2.98 4.62±2.19 5.94±2.94 T (nmol/L) 1.03±0.37 1.31±0.40a 1.31±0.47 AMH (ng/mL) 1.66±0.96 3.90±2.01a 4.42±2.76b, c HCG日FSH (U/L) 18.99±7.84 13.07±4.67a 10.7±3.16b HCG日E2 (pmol/L) 8581.81±3215.38 14907.79±4966.29a 20818.85±7438.47b, c HCG日LH (U/L) 3.14±2.09 2.27±1.10a 2.06±0.82b P (nmol/L) 4.56±2.15 3.07±1.26a 3.58±1.56 Gn (U) 2251.48±831.39 1709.82±603.62a 1333.33±429.31b, c sRAGE (ng/mL) 282.57±168.01 707.36±189.96a 869.84±170.39b, c Number of MII oocytes retrieved 4.24±0.94 12.14±2.36a 20.67±5.05b, c Fertilization rate (%) 58.49±15.95 76.63±16.12a 80.69±18.11b Rate of high-quality embryos (%) 28.33±22.97 41.94±23.67 42.47±21.89 a: Within target response versus below target response; b: Above target response versus below target response; c: Above target response versus within target response.

表 3 卵泡液sRAGE水平在三个不同反应亚组间的分析 Tab.3 Analysis of sRAGE levels in follicular fluid among 3 different subgroups

综上所述，sRAGE作为卵泡微环境中的分泌因子，临床取样简便，检测经济。卵泡液中sRAGE表达与非PCOS患者卵巢储备功能、COH后获卵数与受精率情况密切相关，可以直观地反映非多囊卵巢患者COH后的卵巢反应性，可以为临床控制性促排卵的有效性提供一定的理论基础，为改善卵巢反应不良、胚胎质量不优患者提供依据和预测，从而达到改善ART助孕妊娠结局的目标。