2019, Vol. 39
目前，临床上针对染色体非整倍体的筛查主要依靠血清学筛查和超声学筛查，这两种方法存在较高的假阳性率和漏诊率，而高特异性和高敏感性的无创性产前检测（NIPT）的出现可以弥补这两种方法的缺陷。已有报道显示，无创性产前基因检测应用于染色体非整倍体异常胎儿检测的敏感性为91.7%~100%，特异性为97.9% ~100%[1-11]。由于它的假阴性率极低而检出效率很高，使得这种方法在临床上表现出非常好的应用前景。然而，这种方法在不同人群中的筛查效率是否有差异，尤其是非高龄血清学筛查临界风险人群中的筛查效率以及必要性国内未见报道。本研究分析了2011年10月~ 2018年6月在我院因血清学筛查高风险但拒绝产前诊断或临界风险而行NIPT的非高龄人群，以评估该方法在这部分人群中的筛查效率及必要性。
1 对象和方法 1.1 对象选择2011年10月~2018年6月于我院行无创性产前基因检测的6804例血清学筛查阳性的非高龄孕妇。孕妇预产期年龄21~34岁，孕周12~24周，B超提示单胎、孕前3个月无输血或骨髓移植记录。按照唐氏筛查结果分为两组：高风险组（1/270 ≤ 21三体风险值或1/ 350 ≤ 18三体风险值）3763例，临界风险组（1/1000 ≤ 21三体风险值< 1/270或1/1000 ≤ 18三体风险值< 1/350）3041例。
本研究严格遵守医学伦理学原则，获得了佛山市妇幼保健院伦理委员会的批准。对无创性产前基因检测发现非整倍性高风险者，经遗传咨询后建议其行有创性产前诊断，其中同意行有创性产前诊断者，签署知情同意书后进行胎儿染色体核型分析和/或高通量测序，根据产前诊断结果指导其是否继续妊娠。
1.2 方法 1.2.1 采集并分离样本无菌抽取孕妇外周静脉血5 mL（EDTA-K2抗凝），并于4 h内4 ℃条件下以1600 r/min离心10 mins，将上清转移到新的离心管内，于4 ℃条件下16 000 r/min离心10 mins，最后取上清分装至离心管中，保存于-80 ℃待进一步检测。
1.2.2 无创性产前基因检测方法采用FlexiGene DNA kit（QIAGEN公司，美国）试剂盒提取DNA。采用第二代测序技术，按照标准流程在HiSeq上进行测序，获得原始数据。通过计算测试样本的待测染色体的比例与总体人群的比率之差，除以对照组中待测染色体的方差，所得值成为Z值，若Z值≥ 3或Z值≤ -3，即认为待测样本为三体高危；若-3 < Z值< 3，则为正常样本。
1.2.3 胎儿染色体核型分析和/或高通量测序分析。 1.2.3.1 羊水染色体核型分析方法常规消毒后在超声引导下抽取羊水20 mL，以1000 r/min的转速离心10 min，弃上清液，保留0.5 mL细胞层，混匀并等分为2份，分别接种于2个25 mL无菌培养瓶中，再加入羊水培养基5 mL，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，常规收获及制片，然后吉姆萨染色，镜下观察、记数分散良好的中期分裂相30个，分析3个，显微镜下拍取照片。细胞染色体核型分析按照人类细胞遗传学国际命名体制标准进行核型分析。
1.2.3.2 脐静脉血穿刺核型分析方法在超声引导下选取脐带游离段抽取脐带血1.5 mL，接种于2个血培养瓶中，37 ℃培养箱中培养。脐血培养72 h后进行常规收获、制片、显带、分析。
1.2.3.3 基因芯片分析取1 μg基因组DNA用Q800R超声破碎仪进行打断，电泳质检峰值在350 bp左右，然后根据说明书进行建库。琼脂糖凝胶电泳测定文库的大小，Qubit3.0及荧光定量PCR测定文库的浓度。质检后文库稀释至上机测序浓度，使用Illumina Nextseq 500测序平台进行测序分析，测序结果经生物信息学方法进行数据分析。拷贝数的变异情况通过UCSC数据库（http://genome.ucsc.edu）和Genomic Variants数据库（http://projects.tcag.ca/variation）来判断，并和DECIPHER数据库（http://decipher.sanger.ac.uk/），OMIM数据库（http://omim.org/）以及ISCA数据库（https://www.iscaconsortium.org/isca/ucsc/hg19）比对以判断是否病理性变异。
1.2.4 对所有进行无创性产前基因检测的孕妇进行电话随访 1.2.5 统计分析用χ2检验分析血清学筛查高风险组和临界风险组之间的各项指标之间的差异是否有统计学意义（α=0.05）。
2 结果 2.1 孕妇外周血浆胎儿游离DNA的无创性产前基因检测6801例血清学筛查阳性的非高龄孕妇成功完成无创性产前基因检测，3份因游离DNA浓度过低未达到检测标准而失败。成功检测标本中血清学筛查高风险组3761例，临界风险组3040例。
2.2 无创性基因检测异常结果与有创性产前诊断结果比较3761例唐氏筛查高风险非高龄孕妇外周血DNA产前基因检测染色体非整倍体异常高风险者共70例，其中的53例行进一步产前诊断，34例无创结果与有创性诊断一致（详细情况见表），其中22例21三体高风险相符的，6例18三体高风险相符，4例性染色体异常高风险相符（其中1例为微缺失），2例其他常染色体异常相符（其中1例非整倍体，1例微缺失微重复），另外19例无创结果与有创性诊断结果不符，其中3例21三体高风险不符，3例13三体高分险不符；7例性染色体异常高风险不相符，6例其他染色体异常高风险不相符。结果显示高风险组孕妇无创性产前检测染色体拷贝数异常对21三体检测的灵敏度为95.65%，特异度99.91%，阳性预测值88.0%，假阳性率0.09%，假阴性率4.35%；对18三体检测的灵敏度100%，特异度100%，阳性预测值100%，假阳性率0，假阴性率0。对13三体检测的假阳性率0.09%，假阴性率0；对性染色体非整倍体异常检测的灵敏度100%，特异度99.80%，阳性预测值30.0%，假阳性率0.2%，假阴性率0；对其他染色体非整倍体异常检测的灵敏度100%，特异度99.88%，阳性预测值16.60%，假阳性率0.18%，假阴性率0。
3040例唐氏筛查临界风险非高龄孕妇外周血DNA产前基因检测染色体非整倍体异常高风险者共54例，其中36例行进一步产前诊断，相符的21例，包括13例21三体高风险相符，6例性染色体异常高风险相符的，2例其他常染色体异常高风险相符。15例无创性检测结果与有创性产前诊断结果不符，包括3例18三体高风险不相符的，1例13三体高风险不符的，6例性染色体异常高风险不相符，5例其他染色体不相符的。临界风险组孕妇无创性产前检测染色体拷贝数异常对21三体检测的灵敏度为100%，特异度100%，阳性预测值100%，假阳性率0，假阴性率0；对18三体检测的阳性预测值0，假阳性率0.11%，假阴性率0。13三体检测的假阳性率0.04%，假阴性率0；对性染色体异常检测的灵敏度100%，特异度99.79%，阳性预测值50%，假阳性率0.21%，假阴性率0；对其他染色体非整倍体异常检测的假阳性率0.18%，假阴性率0。
2.3 随访结果所有行无创性产前基因检测的孕妇均随访胎儿出生情况至产后42 d，经电话随访有效者6224例（随访有效率：91.51%），其中高风险组3425例（随访有效率：91.07%），临界风险组2799例（随访有效率：92.07%）。随访失败577例，其中唐氏筛查高风险组336例，临界风险组241例。产前无创基因检测染色体拷贝数异常高风险人群中有6个胎儿无明显异常而选择自行引产的，3个因胎儿结构异常或胎死宫内引产，21个拒绝产前诊断坚持继续妊娠并生产，胎儿外观未发现异常，9个失访，有2个经有创性产前诊断确诊胎儿为唐氏综合征者未引产。截止至2018年12月31日，已随访的无创性检测结果阴性结果的新生儿出现1例唐氏综合征患儿，其母亲属于高风险组。
2.4 统计分析高风险组和临界风险组的无创性产前基因检测的阳性率、特异度和阳性预测值差别均无统计学意义（P> 0.05，表 3）。
|
表 1 血清学筛查高危组NIPT检测阳性结果及妊娠结局 Tab.1 Positive results of noninvasive prenatal genetic testing in serum screening high-risk group and the pregnancy outcomes |
|
|
表 2 血清学筛查临界风险组NIPT检测阳性结果及妊娠结局 Tab.2 Positive results of noninvasive prenatal genetic testing in serum screening critical-risk group and the pregnancy outcomes |
|
|
表 3 两组结果差异性统计学分析结果 Tab.3 Diagnostic performance of noninvasive prenatal genetic testing for trisomy 21 and abnormal sex chromosome in the two groups |
1997年，香港中文大学卢煜明团队首次报道，在孕妇血液循环中存在游离的胎儿DNA[12]，2008年，Chiu和Fan等[13-14]先后证实了基于第二代测序技术的无创性检测方法在产前筛查非整倍体的可行性。2010年卢卢煜明团队[15]证明了在母体血浆中存在胎儿的全基因组序列，这些研究为无创性产前检测胎儿染色体疾病和基因组病打下了良好的理论基础。
本研究结果显示，NIPT在血清学筛查高风险人群中检测21三体的灵敏度、特异度和阳性预测值分别是是95.65%、99.91%和88.0%，在临床上，唐氏筛查高风险人群中，相当一部分孕妇因为各种原因（比如，珍贵胎儿、害怕穿刺风险等）不愿意行有创性产前诊断，还有一部分存在有创性产前诊断的禁忌症，例如：先兆流产、术前两次体温高于37.2 ℃、有出血倾向（血小板≤ 70×109/L，或凝血功能检查有明显异常）、有盆腔感染或宫腔感染征象等，无创性产前基因检测为她们提供了一条最大程度避免唐氏综合征患儿的出生的途径。在血清学筛查临界风险非高龄人群中NIPT检测21三体的灵敏度、特异度和阳性预测值分别是是100%、100%和100%。唐氏筛查临界风险的人群基数很大，其数量远大于唐氏筛查高风险人数，但是愿意选择有创性产前诊断的比例很小。我们的研究结果显示，这部分人群生育唐氏儿的风险为0.46%，即2799个临界风险孕妇的胎儿中，有13例唐氏综合征患儿，所以这部分人群很有必要进行进一步的检测，为《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》中规定唐氏筛查临界风险人群为无创产前检测技术的适宜人群提供了支持。
高风险组人群中，18三体的检出率达到100%，并且没有出现假阴性病例，说明该技术对于18三体具有很好的检测能力。另外，结果表明，无创性产前基因检测对性染色体异常具有很高的特异性和敏感度：筛查性染色体非整倍体异常的的灵敏度、特异度和阳性预测值在两组人群中分别是100%和98.80%（高风险组）、100%和98.79%（临界风险组），但是阳性预测值较低：两组分别为：高风险组和临界风险组，这和已有报道结果一致[16-17]。
对于其他染色体非整倍体异常的灵敏度、特异度和阳性预测值是100%（高风险组）、99.88%（高风险组）、16.6%（高风险组）。所以，无创性产前基因检测不仅对21三体、18三体具有很好的检出能力，同时对性染色体非整倍体异常和其他染色体非整倍体异常具有较好的检出能力，所以可以明显降低因未行有创性产前诊断而导致的染色体异常漏检率。另外，在两组人群中共发现5例嵌合体病例，异常染色体嵌合比例最低为5%，说明该方法检测非整体的敏感性很高。
目前，血清学筛查的假阳性率一般要求是5%以下，检出率只有60%~80%[18-20]，因此漏筛率或假阴性率比较高，而无创性产前基因检测的假阳性和假阴性率都很低，所以无创性产前基因检查弥补了血清学筛查的缺陷。我们的研究结果显示该技术对21三体、18三体、性染色体非整倍体异常、其他染色体非整倍体异常具有很高的敏感度和灵敏度，一方面大幅降低有创性产前诊断的数量，节约大量的宝贵医疗资源，另一方面可以最大程度避免染色体非整倍体患儿的出生。统计学分析显示，无创性产前基因检测在这两组人群中对21三体、性染色体非整倍体异常的特异度、敏感度以及阳性预测值差别无统计学意义，由于临界风险组无18三体和其他染色体非整倍体异常真阳性病例，两组人群均未出现13三体真阳性病例，所以无法统计分析该方法在检测18三体、13三体和其他染色体非整倍体上是否有差别。然而，无创产前基因检测作为一种筛查手段，并不能代替有创性产前诊断，因此对阳性结果的遗传咨询非常重要[21-22]，必须说明这一结果的含义以及建议行有创性产前诊断。另外，对于NIPT检测低风险人群的咨询同样重要，说明假阴性可能性，建议后续超声检查密切监测，如超声发现异常，则应该建议进一步行有创性产前诊断，最大程度减少假阴性病例的出生。本研究中出现1例21三体假阴性病例，据报道，NIPT假阴性的原因有以下几方面：（1）当胎盘细胞滋养层细胞正常，胎儿和间充质核心均存在嵌合时，可导致NIPT结果假阴性；（2）当胎盘细胞滋养层细胞、间充质核心和胎儿三者均存在嵌合，但是在细胞滋养层中异常细胞系的嵌合比例低于一定值时，NIPT可能检测不到外周血中异常的DNA，从而导致假阴性结果[23]；（3）局限性胎儿嵌合（Confined fetal mosaicism, CFM），即异常染色体仅存在于胎儿，而胎盘染色体正常，是一种非常罕见（发生率约0.003%）的嵌合形式，也可导致NIPT假阴性[24]。
另外，本研究发现，对于较大片段的缺失和重复，无创性产前基因检测具有一定的检测能力。本研究中，高风险组检出一例9号染色体微缺失患儿，缺失片段片段为3.8 Mb，由于数据库显示为多态性而选择继续妊娠。在临界风险组，检出1例21号染色体微缺失，缺失片段为2.06 Mb。这说明对于一定程度的染色体拷贝数重复和缺失，该项技术具备潜在的检测能力。2016年，卢煜明等[25]对18例经产前诊断已确诊微重复或微缺失片段大于6 Mb的病例进母体血浆DNA的检测，15例可以检出至少一个微缺失或微重复。Liang等[26]应用无创性检测技术发现一例9号染色体微重复，经确诊后和无创检测结果一致，也证明了无创性检测技术很有可能应用于染色体微重复和微缺失甚至单基因病的检测，从而在临床上的应用范围进一步扩展。
已有报道分别对唐氏筛查高风险人群和临界风险人群的无创性非整倍体筛查进行分析，但是未将高龄人群和低龄人群区分开。据报道，唐氏筛查的高风险人群中NIPT筛查的阳性率为0.53%~2.4%[27-31]，在临界风险人群中NIPT筛查的阳性率为：0.58%~0.85%[32-33]。在本研究中，3761例唐氏筛查高风险非高龄孕妇外周血DNA产前基因检测染色体拷贝数异常者共70例，阳性率1.86%，3040例唐氏筛查临界风险非高龄孕妇外周血DNA产前基因检测染色体拷贝数异常54例，阳性率为1.78%。然而，目前尚未见非高龄人群血清学筛查临界风险人群中的筛查必要性，以及对非高龄人群唐氏筛查高风险人群和临界风险人群的NIPT技术的筛查效率进行比较的报道，本研究结果显示，在非高龄人群血清学筛查临界风险人群中进行NIPT筛查非常有必要，并且，在两组人群中，NIPT技术的筛查效率差异没有统计学意义（P>0.05）。
目前，无创性产前测序技术在检测胎儿染色体非整倍性方面仍然存在一些缺点：检测成本较高；少数游离DNA含量不够而检测失败；不能检出染色体平衡易位及结构异常患者；存在假阳性及假阴性风险。所以该技术的应用应该针对合适的人群，并且尽量避免不适宜人群的应用。
综上所述，随着测序技术的快速发展，检测成本也在不断下降，这也为该技术在临床上广泛应用创造了有利条件，除了在非整倍体检测方面显示出来的巨大优势，无创性产前基因检测在染色体微重复及微缺失以及单基因病的检测上显示出强大的潜力，使得该技术在临床上的应用前景十分广阔。
| [1] |
Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study[J]. Genet Med, 2011, 13(11): 913-920. DOI:10.1097/GIM.0b013e3182368a0e |
| [2] |
翁慧男, 梁嘉颖, 曾伟宏, 等. 无创产前基因测序在胎儿染色体非整倍体基因检测中的临床应用[J]. 国际检验医学杂志, 2015, 36(16): 2386-8. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.16.041 |
| [3] |
Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J]. Obstet Gynecol, 2012, 119(5): 890-901. DOI:10.1097/AOG.0b013e31824fb482 |
| [4] |
Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-invasive chromosomal evaluation (NI CE) study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18[J]. Am J Obstet Gynecol, 2012, 207: 137.e1-8. DOI:10.1016/j.ajog.2012.05.021 |
| [5] |
Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, et al. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18[J]. Am J Obstet Gynecol, 2012, 206(4): 322.e1-5. DOI:10.1016/j.ajog.2012.01.029 |
| [6] |
林颖, 胡平, 马定远, 等. 胎儿常见染色体非整倍体无创基因检测结果分析与遗传咨询[J]. 中华医学遗传学杂志, 2014, 31(5): 672-3. DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2014.05.031 |
| [7] |
Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, et al. Optimal detection of fetal chromoso-mal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood[J]. Clin Chem, 2011, 57(7): 1042-9. DOI:10.1373/clinchem.2011.165910 |
| [8] |
吴玥丽, 张琳琳, 赵玲, 等. 外周血胎儿游离DNA检测在无创性产前诊断中的价值[J]. 中国计划生育学杂志, 2018, 26(12): 1220-2. |
| [9] |
韦春杏, 李小芬, 王丽娟. 孕期无创性产前胎儿染色体非整倍体基因检测技术在临床的应用价值[J]. 中国优生与遗传杂志, 2018, 26(7): 25-7. |
| [10] |
米中华, 周丽, 司冬梅. 无创DNA检测联合超声软标记筛查胎儿染色体异常的应用[J]. 中国医学工程, 2015, 23(6): 65-6. |
| [11] |
Iwarsson E1, Jacobsson B2, 3, Dagerhamn J4, Davidson T4, 5, Bernabé E6, Heibert Arnlind M4, 7. Analysis of cell-free fetal DNA in maternal blood for detection of trisomy 21, 18 and 13 in a general pregnant population and in a high risk population-a systematic review and meta-analysis[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2017, 96(1): 7-18. DOI:10.1111/aogs.13047 |
| [12] |
Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet, 1997, 350(9076): 485-7. DOI:10.1016/S0140-6736(97)02174-0 |
| [13] |
Chiu RW, Chan KC, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chro-mosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(51): 20458-63. DOI:10.1073/pnas.0810641105 |
| [14] |
Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(42): 16266-71. DOI:10.1073/pnas.0808319105 |
| [15] |
Lo YM, Chan KC, Sun H, et al. Maternal Plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus[J]. Sci Transl Med, 2010, 2(61): 61-91. |
| [16] |
徐燕, 袁幼红, 王琳琳, 等. 无创产前基因检测筛查胎儿性染色体异常的临床意义探究[J]. 中外医学研究, 2019, 17(3): 57-9. |
| [17] |
王海, 周蕾, 王克义, 等. 大规模平行测序无创基因检测用于胎儿染色体非整倍体异常产前诊断的临床价值[J]. 浙江医学, 2018, 40(1): 12-5. |
| [18] |
陈雪娇, 孙玲, 戴美珍, 等. 无创产前基因检测在性染色体非整倍体产前检查中的应用[J]. 中华医学遗传学杂志, 2015, 32(2): 296-8. DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2015.02.033 |
| [19] |
刘子建, 梁德杨, 陈敏, 等. 唐氏综合征的产前筛查模式和临床应用[J]. 中华妇产科杂志, 2010, 45(6): 473-6. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2010.06.021 |
| [20] |
金玉霞, 苗正友, 葛加美, 等. 应用大规模平行基因组测序技术无创产前诊断胎儿常见染色体非整倍体异常[J]. 中华医学杂志, 2014, 23(10): 1788-90. |
| [21] |
方美仙, 王燕, 何德钦, 等. 2912例无创性产前基因检测的指征及结果分析[J]. 中国妇幼保健, 2017, 32(22): 5665-8. |
| [22] |
Revello R, Sarno L, Ispas A, Akolekar R, Nicolaides KH. Screening for trisomies by cell-free DNA testing of maternal blood: consequences of a failed result[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2016, 47(6): 698-704. DOI:10.1002/uog.15851 |
| [23] |
Canick JA, Palomaki GE, Kloza EM, et al. The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on next generation sequencing tests for common fetal aneuploidies[J]. Prenat Diagn, 2013, 33(7): 667-74. DOI:10.1002/pd.4126 |
| [24] |
Pittalis MC, Dalpra L, Torricelli F, et al. The predictive value of cytogenetic diagnosis after CVS based on 4860 cases with both direct and culture methods[J]. Prenat Diagn, 1994, 14(4): 267-78. DOI:10.1002/pd.1970140406 |
| [25] |
Lo KK, Karampetsou E, Boustred C, et al. Limited clinical utility of Non-invasive prenatal testing for subchromosomal abnormalities[J]. Am J Hum Genet, 2016, 98(1): 34-44. |
| [26] |
Liang D, Lv W, Wang H, et al. Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome aneuploidy by massively parallel sequencing[J]. Prenat Diagn, 2013, 33(5): 409-15. DOI:10.1002/pd.4033 |
| [27] |
季修庆, 林颖, 胡平, 等. 无创产前基因检测在血清学筛查结果为高风险的非高龄孕妇中的应用[J]. 临床检验技术研究, 2015, 33(2): 85-7. |
| [28] |
刘静, 王华, 席惠, 等. 新一代测序技术用于胎儿染色体非整倍体无创产前检测的研究[J]. 中华医学遗传学杂志, 2015, 32(4): 533-7. DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2015.04.019 |
| [29] |
菀华, 李巧仪, 林洋洋. 无创性产前基因检测在唐氏高危人群中的应用效果[J]. 黑龙江医学, 2015, 39(7): 811-2. DOI:10.3969/j.issn.1004-5775.2015.07.039 |
| [30] |
贾海珍. 无创性产前基因检测在唐氏高危人群中的应用[J]. 中外医学研究, 2014, 12(31): 19-20. |
| [31] |
杨灿锋, 吴晓. 孕妇血浆中胎儿游离DNA测序在无创性产前检测中的应用[J]. 实用妇产科杂志, 2015, 31(11): 866-9. |
| [32] |
潘婕文, 鲍幼维, 潘小莉, 等. 无创产前基因检测在血清学筛查临界风险孕妇中的应用研究[J]. 中国优生与遗传杂志, 2017, 25(12): 8-9. |
| [33] |
涂新枝, 段纯, 李玉哲, 等. 无创胎儿DNA检测在2949例传统唐氏筛查临界风险孕妇中的应用[J]. 天津医药, 2017, 45(2): 180-3. |