2019, Vol. 39
2. 安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230021;
3. 安徽中医药大学 医药信息工程学院，安徽 合肥 230021
2. College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230021, China;
3. College of Information Engineering, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230021, China
中风病是世界范围内主要的致残原因[1-2]。神经干细胞（NSCs）在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用[3-6]。脑缺血病变后内源性NSCs的再生是机体实现自身修复的潜力。NSCs在脑缺血后增殖分化的速度与抑制其再生有关[7-9]。当NSCs向损伤灶局部迁移时，其量及有效分化程度却明显不足，甚至失去迁移能力[10-11]。因此，对于缺血性中风NSCs增殖分化及其干预研究有重要意义。中药复方治疗缺血性中风病有较好疗效，中医药在治疗缺血性中风凸显重要作用[12-13]。脑络欣通具有促进NSCs增殖的作用。脑络欣通可诱导NSCs分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，同时，脑络欣通能改善NSCs增殖的微环境[14-18]。既往研究主要集中在脑络欣通对NSCs增殖、分化作用，而对NSCs增殖分化的特征性标志物及分化程度研究较少，且缺乏脑络欣通对NSCs分化过程的动态观察研究。而缺血性中风在疾病不同时期NSCs的增殖分化程度不同，故本文着重以脑络欣通对NSCs的不同时间节点观察，并动态观察缺血后内源性NSCs分化为神经元细胞和胶质细胞的共同标记物β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）/胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的变化，以期更好了解脑络欣通的作用靶点。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞和分组C17.2小鼠永生化NSCs细胞株（ATCC，zs100493）。将NSCs细胞株分为空白模型组（MC）、10%脑络欣通含药血清组（NLXT）、10%脑络欣通含药血清+Y27632组（以下简称Y-27632组）。
1.1.2 药物含药血清：取10只大鼠并标记为NLXT组，中药材由安徽广印堂中药股份有限公司提供。按NLXT原方比例分别称取黄芪30 g（批号：160902），川芎10 g（批号：160901），三七6 g（批号：160901），天麻10 g（批号：160801），当归10 g（批号：160803），红花10 g（批号：160801），蜈蚣2条（批号：160801）。将称取的药材（除去蜈蚣）加入砂罐中，常规煎煮得出煎煮液。将煎煮液低速离心取上清液过滤，再用旋转蒸发仪浓缩至1 mL含生药1 g。NLXT组按8.54g/（kg·d）灌胃共给药3 d，并于第3天最后一次灌胃后取血清备用。
1.1.3 主要试剂和仪器Transwell小室（Corning，Cat. No：3422，Lot.No：26117004），胎牛血清（MRC，Cat.No：CCS30009.02，Lot.No：S171204F），NSCs成神经元诱导分化培养基（Cyagen，Cat.No：MUXNX-90081，Lot.No：T171206G001），DMEM（Hyclone，Cat.No：SH30022.01，Lot.No：AC13298765），DMEM/F12（Hyclone，Cat.No：SH30023.01，Lot.No：AC11256314），DMSO（Solarbio，Cat.No：D8370，Lot.No：11773002），MTT（Solarbio，Cat. No：D8370，Lot.No：1172103），山羊抗兔-FITC二抗（Zsbio，Cat.No：ZF-0311，Lot.No：1345863），TRITC二抗（Zsbio，Cat.No：ZF-0313，Lot.No：133502），β-Actin（Zsbio，Cat.No：TA-09，Lot.No：18AV0403），甘氨酸（Solarbio，Cat.No：G8200，Lot.No：109J063），Tris（Solarbio，Cat.No：G8060，Lot.No：117W074），Tween-20（Solarbio，Cat.No：T8200，Lot.No：822I0424），预染蛋白Marker（Thermo，Cat.No：26616G8060，Lot.No：610351），PVDF膜（Millipore Cat.No：IPVH00010，Lot.No：R7JA4305G），ECL超敏反光试剂盒（Millipore Cat.No：34094，Lot.No：SF249607），GFAP小鼠抗小鼠（Bioss，Cat.No：bsm-33065M，Lot.No：AH03084346），β-tubulin Ⅲ兔抗小鼠（Bioss，Cat.No：bs-2670R，Lot.No：AG09273217），Brdu诱导剂（Sigma，Cat.No：B5002，Lot.No：11D037），Brdu小鼠抗小鼠（Bioss，Cat.No：bsm-0917M，Lot.No：AG08255316），双皮质素（DCX）兔抗小小鼠（Bioss，Cat.No：bsm-33065M，Lot.No：AG08255429），NeuN兔抗小鼠（Bioss，Cat.No：bs-10394R，Lot.No：AG07113117）。
1.2 实验方法 1.2.1 NSCs特征性标志蛋白巢蛋白（Nestin）鉴定将细胞悬液培养并予血清封闭。加一抗和相应种属二抗室温孵育50 min；细胞核复染并避光室温孵育。封片并镜检拍照。
1.2.2 NSCs细胞活性测定及细胞迁移观察采用MTT法检测NSCs细胞活性。Transwell小室观察NSCs迁移。光学显微镜下观察并随机拍照5个视野，计算每视野的侵袭细胞数，计算平均值。视野中显示的细胞即为穿过transwell小室底膜的细胞。
1.2.3 免疫印迹法观察β-TubulinⅢ、GFAP、MAP-2蛋白表达收集细胞并提取细胞蛋白；蛋白上样与电泳（电泳浓缩胶和分离胶的配方见表 1）；转膜并封闭液封闭。4 ℃一抗孵育和二抗孵育；凝胶成像系统扫描并计算条带灰度值，以β-TubulinⅢ、GFAP、MAP-2与β-actin灰度值比值为相对表达量。
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表 1 电泳浓缩胶与分离胶的比例 Tab.1 Electrophoretic concentrated gel and separation gel ratio |
显色剂DAPI染核，呈蓝色；显色剂FITC标记DCX、NEUN、β-TubulinⅢ，呈绿色；显色剂TRITC标记Brdu、GFAP，呈红色。
1.2.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件分析，数据用均数±标准差表示。组间比较用单因素方差分析。P < 0.05具有统计学差异。
2 结果 2.1 NSCs特征性标志蛋白Nestin鉴定荧光显微镜下观察发现，当细胞出现明显的绿色荧光和染细胞核的蓝色荧光，说明C17.2细胞株复苏、传代成功（图 1）。
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图 1 C17.2细胞株复苏传代后nestin染色 Fig.1 Nestin staining of resuscitated of C17.2 cell line (Original magnificatio: ×100). A, B, C: Fluorescent staining of the cells before induction; D, E, F: Fluorescent staining of the cells at 1 day of induction. |
MTT检测结果显示，与MC组比较，第7天NLXT组和Y-27632组细胞存活率明显升高（P < 0.05，图 2）。transwell法观察NSCs迁移结果显示，与MC组比较，第1天和第3天NLXT组、Y-27632组迁移细胞数增多（P < 0.05）；第7天NLXT组、Y-27632组迁移细胞数显著增多（P < 0.01，图 3）。
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图 2 脑络欣通对NSCs活性的影响 Fig.2 Effect of NLXT on the activity of NSCs. △P < 0.05 vs MC group. |
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图 3 脑络欣通对NSCs迁移的影响 Fig.3 Effect of Naoluo Xintong on the migration of NSCs. A, B, C: Number of migrated cells on day 1, 3, and 7, respectively (× 100); D: Comparison of the number of migrated cells. △P < 0.05, △△P < 0.01 vs MC group. |
第1天β-tubulinⅢ、MAP-2和GFAP在各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。与MC组比较，第3天、第7天NLXT组和Y-27632组β-tubulinⅢ、MAP2、GFAP蛋白表达显著升高（P < 0.01或P < 0.05，图 4~6）。
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图 4 β-tubulinⅢ的表达 Fig.4 Expression of β-tubulin Ⅲ protein in the cells detected by Western blotting on day 1 (A), 3(B), and 7(C) with quantitative analysis (D). △P < 0.05, △△P < 0.01 vs MC. |
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图 5 MAP-2的表达 Fig.5 Expression of MAP-2 protein in the cells detected by Western blotting on day 1(A), 3 (B), and 7(C) with quantitative analysis (D). △△P < 0.01 vs MC. |
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图 6 GFAP的表达 Fig.6 Expression of GFAP protein in the cells detected by Western blotting on day 1 (A), 3(B), and 7(C) with quantitative analysis (D). △△P < 0.01 vs MC. |
免疫荧光标记β-tubulinⅢ/GFAP表达观察发现，β- tubulinⅢ阳性反应呈绿色，GFAP呈红色，MC组中星形胶质细胞少量表达。NLXT组在第1天, 第3天和第7天β-tubulinⅢ阳性细胞明显增多，Y-27632组β-tubulinⅢ和GFAP阳性细胞明显增多，第7天达到最高峰且分布均匀（图 7）。神经元新生特异性标记BrdU/DCX免疫荧光显示：MC组见极少量BrdU/DCX标记阳性细胞；NLXT组有少量标记阳性细胞，双染散在细胞数目有限，第1天, 第3天与第7天比较未出现增多；Y-27632组BrdU/DCX标记阳性细胞增多，且第7天阳性细胞数比第1天，第3天明显增多（图 8）。
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图 7 β-tubulinⅢ/GFAP阳性细胞表达 Fig.7 Expression of β-tubulinIII/GFAP in the NSCs detected by immunofluorescence assay on day 1 (A), 3 (B), and 7 (C) (× 200). |
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图 8 BrdU/DCX阳性细胞表达 Fig.8 Expression of BrdU/DCX in the NSCs detected by immunofluorescence assay on day 1 (A), 3 (B), and 7 (C) (×200). |
BrdU/NEUN免疫荧光标记为分化成熟神经元特异性标记，MC组BrdU/NEUN标记阳性细胞呈富集性，分布均匀；NLXT组标记细胞数目较空白组明显增多，且逐渐分布规律；Y-27632组与空白组、NLXT组比较，BrdU/NEUN标记阳性细胞数目呈进一步增多，分化明显，分布均匀，细胞形态完好（图 9）。
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图 9 BrdU/NEUN阳性细胞表达 Fig.9 Expression of BrdU/NEUN in the NSCs detected by immunofluorescence assay on day 1 (A), 3 (B), and 7(C) (×200). |
脑缺血中风发生后脑组织可自发诱导NSCs增殖和分化，NSCs对损伤脑组织进行修复，脑组织缺血缺氧早期NSCs标志蛋白Nestin蛋白表达升高预示NSCs的激活，修复脑损伤[19-20]。因此，Nestin蛋白表达水平可作为判断中枢神经系统修复能力的指标，Nestin可反映脑组织中NSCs变化。并且，NSCs在脑缺血早期可有效进行神经功能维持和恢复，显著降低脑组织损伤程度[21-23]。本实验结果显示，空白模型组中在第1天，第3天可见少量表达Nestin标记阳性细胞，细胞体形态及排列不规整；第7天时Nestin阳性细胞数目进一步增多，反应更加强烈。脑络欣通组和阻滞剂组，脑缺血第1天时Nestin表达开始明显增加，第3天时Nestin表达显著增强，第7天时Nestin表达进一步增强。说明脑缺血中风发生后会重塑NSCs再生，而脑络欣通能和抑制剂作用类似，可迅速促进NSCs的增殖，并进一步修复损伤细胞。
β微管蛋白在NSCs由圆形分化为有极性的神经元过程中发生变化。β微管蛋白具有七个同源体, 其中β-微管蛋白-Ⅲ具有神经元特异性, 它是原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一。GFAP是神经胶质细胞标记物。本实验采用β-tubulinⅢ/GFAP共同标记来观察脑缺血后内源性NSCs分化为神经元细胞和胶质细胞的变化，从而进一步观察脑络欣通对NSCs增殖、分化的影响。实验结果显示，第1天时β- tubulinⅢ和GFAP阳性细胞明显增多，第3天，第7天呈现逐渐减少趋势；脑络欣通组β-tubulinⅢ阳性细胞都明显增多，GFAP阳性细胞变化不明显。阻滞剂组GFAP阳性细胞从第1天到第7天逐渐减少，β-tubulinⅢ阳性细胞增多且分布较为规律，与时间呈现正相关性。DCX与神经元迁移和分化相关，采用免疫荧光标记DCX/BrdU反应神经再生过程中迁移的NSCs。BrdU/DCX免疫荧光标记为神经元新生特异性标记，通过观察BrdU/DCX免疫荧光标记阳性细胞变化，可反映脑缺血损伤后NSCs分化情况。实验结果显示空白模型组见极少量BrdU/ DCX标记阳性细胞，空白模型组有少量标记阳性细胞。脑络欣通组和阻滞剂组BrdU/DCX标记阳性细胞增多，且第7天比第1天和第3天明显增多，且分布规律，呈集中分布。BrdU标记具有增殖迁移和分化能力的神经细胞。采用免疫荧光标记NeuN/BrdU反应神经再生过程中由NSCs新分化而来的神经元细胞。BrdU/ NEUN免疫荧光标记为分化成熟神经元特异性标记，空白模型组标记阳性细胞数目明显减少，第3天减少最为明显；脑络欣通组和阻滞剂组标记阳性细胞数目较空白组明显增多，第7天增多明显且逐渐分布规律。以上研究结果均提示脑络欣通具有类Y-27632样作用，能推动轴突再生促进神经干细胞的增殖，诱导分化。
前期研究发现[24-26]脑络欣通临床上治疗脑血管疾病疗效显著[27-30]。元气充足，则气能摄血，血液贯通于脉络，使血液循环畅通，而血循脉道则血液上于脑窍，保证大脑组织血液和氧气供应充足。气旺以生新血使化生有源。因此，在治疗缺血性中风病气虚血瘀证时应予“益气活血通络”法[32]。遵从“益气活血通络”法拟定的中药复方“脑络欣通”，全方由黄芪、川芎、三七、蜈蚣等组成。黄芪具有补气之功效，补气主要是改善机体功能状态，补气则消除脉中之瘀；气旺以生血活血，从而改善脑部血液循环。川芎具有活血、通络止痛功效。川芎活血而顺畅，使得机体气血渗灌脉络。三七具有活血化瘀之功；三七佐以蜈蚣则血脉疏通。脑络欣通全方扶正祛邪、攻补兼施，活血中寓以补气，使气贯经脉以助血行，营血流畅经脉得养。本研究通过脑络欣通对NSCs增殖和分化观察发现，脑络欣通干预后，GFAP阳性细胞从第1天到第7天逐渐减少，β-tubulinⅢ阳性细胞增多且分布较为规律，与时间呈现正相关性。说明脑络欣通能够促进NSCs向神经元细胞和胶质细胞分化，修复损伤细胞。
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