最新研究表明，作为肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要效应分子之一，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）参与了心血管和其他疾病的病理过程，包括心血管疾病^[1-2]和肾脏疾病^[3]。富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）又被称为CCN1，是CCN家族成员之一，是由内皮细胞及成纤维细胞分泌产生的细胞基质蛋白^[4]。Cyr61具有多种功能，近年来研究发现，在病理条件下，Cyr61通过调控细胞迁移、黏附、增殖、凋亡等参与了包括自身免疫性疾病、急慢性炎性疾病、心血管性疾病及肿瘤的发生与发展^[5-7]。Cyr61还参与了包括胚胎发育、血管生成、伤口愈合等众多机体正常的生理活动^[8-10]。目前有关AngⅡ和Cyr61之间的相互作用的研究甚少，有几项研究表明在血管平滑肌细胞中AngⅡ可以刺激Cyr61的表达并影响细胞的生长^[11-12]，但是其具体作用机制仍然不明确，所以深入研究Cyr61在AngⅡ相关性疾病中的变化及作用对疾病的诊断与治疗有着重要意义。

本研究采用CRISPR/Cas9敲除质粒敲低HEK293T细胞Cyr61基因，并用AngⅡ干预HEK293T细胞，利用流式细胞仪检测细胞凋亡，qRT-PCR及Western blot方法检测HEK293T细胞Cyr61及Bcl-2的表达变化，从而探索Cyr61在AngⅡ诱导HEK293细胞功能中的改变及作用。

HEK293T细胞株(南加利福尼亚大学Keck医学中心惠赠，冻存于右江民族医学院科学实验中心），Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒、HDR转染质粒和Ultracruz转染试剂（Santa Cruz Biotechnolog），DMEM细胞培养基、胎牛血清（Gibco），AngⅡ（索莱宝），Annexin VFITC、PI凋亡试剂检测盒（BD），细胞周期检测试剂盒（凯基生物），兔抗Cyr61一抗（Santa Cruz）、兔抗Bcl-2一抗（Abcam）、鼠抗GAPDH一抗（Proteintech），羊抗鼠、羊抗兔IgG抗体（二抗）（碧云天）。蛋白酶抑制剂混合物（康为世纪），BCA蛋白定量试剂盒（碧云天）。RNAiso Plus RNA提取试剂盒（9108，TaKaRa），PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A，TaKaRa），Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit（638315，clontech），SYBR Premix Ex TaqTMII（RR820A，TaKaRa），PCR引物设计与合成由生工生物工程有限公司完成，GAPDH：上游引物：5'-GAGGAGGCATTG CTGATGAT-3'，下游引物：5'-GAAGGCTGGGGCTC ATTT-3'；Cyr61：上游引物：5'-GCGGTTCCGATGCA GAGATGG-3'，下游引物：5'-GATGCTTGCGCTTCTC CTCTGTC-3'；Bcl-2：上游引物：5'-TCCTTCCAGCCT GAGAGCAACC-3'，下游引物：5'-TCACGACGGTAG CGACGAGAG-3'。

正常HEK293T细胞和敲低Cyr61 HEK293T细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃，5% CO₂环境中传代培养。2~3 d换液1次。细胞融合至80%左右消化传代。

按每孔2×10⁵/mL在六孔板接种HEK293T细胞，常规培养至70%融合时更换无血清培养液，将1.0 μg Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒和1.0 μg HDR转染质粒加入到150 μL无血清无抗生素的培养基中并充分混匀，于室温下孵育5 min；将10 μL Ultracruz转染试剂加入140 μL无血清无抗生素的培养基中充分混匀，于室温下孵育5 min；将上述两种混合液一起混匀后于常温下混合孵育10 min后加入无抗生素含10%FBS的培养基使最终体积为2 mL加入含HEK293T细胞的六孔板内。转染48 h后于荧光显微镜下观察转染情况。转染成功后48~96 h观察细胞状态，生长状态良好时，加入8 μg/mL的嘌呤霉素（Puromycin）选择转染细胞，直至正常细胞完全死亡，得到稳定转染细胞系。并用Western blot法鉴定转染结果。将HEK293T细胞分为4组：对照组、Cyr61敲低组、AngⅡ组和Cyr61敲低+ AngⅡ组。并按照前面所述分组将两种类型细胞按照每孔2×10⁵/mL接种于六孔板内，待细胞生长达到70%融合时，吸去原培养液并用冷的PBS洗涤2次，每孔更换新的含10%胎牛血清的DMEM培养基2 mL，并在对应孔内加入AngⅡ，使其终浓度为10^-7 mol/L ^[13]，在37 ℃、5%CO₂饱和湿度条件下继续培养。培养48 h后收集各组细胞进行后续实验检测。

依照分组用AngⅡ干预HEK293T 48 h后收集各孔上清液于离心管中备用，然后再将各组细胞用4 ℃ PBS清洗2次，胰酶消化后与前述上清液共同制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×l0⁶/mL，取l00 μL细胞悬液加入5 μLAnnexinV-FITC和5 μL PI溶液混匀，室温避光孵育l5 min，加入400 μL PBS，流式细胞仪进行检测。重复试验3次。

将转染Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒的HEK293T细胞及正常HEK293T培养48 h后，按照RNAiso Plus RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA。取1 μg总RNA反转录合成cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进。使用LightCycler^® 96实时荧光定量PCR仪进行检测。选取GAPDH作为内参，检测Cyr61、Bcl-2及GAPDH的mRNA表达。以2^-△△CT法计算相对表达量^[14]，ΔΔCT=（CT实验组目的-CT实验组内参）-（CT对照组目的-CT对照组内参）。重复试验3次。

依照分组用AngⅡ干预HEK293T 48 h后收集各组细胞用预冷的PBS液洗2次，加入150 μL预冷PI裂解液，冰浴30 min，刮勺收集样本，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，以二喹琳甲酸（BCA）法测定提取蛋白质量浓度。每个样本取30~50 μg蛋白加入5×SDS上样缓冲液煮沸变性后，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，湿式电印迹法300 mA恒流转至PVDF膜，3%BSA室温封闭1 h，加TBST洗膜缓冲液洗3次，每次10 min，加入一抗孵育4 ℃过夜，加TBST洗膜缓冲液洗3次，每次10 min，加入HRP标记的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（H+L），常温震荡孵育1 h，洗涤后采用ChemiDocXRS凝胶成像系统Qµnatity One软件采集图像，灰度值采用NIH Image软件（National Institute of Health, Bethesda, Md, USA）测定。以目的蛋白条带与GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示其相对含量。重复试验3次。

采用SPSS23.0统计软件进行数据分析，所有数据均进行正态分布和方差齐性检验。服从正态分布的数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析。非正态分布则以中位数和极值表示，采用秩和检验。每个实验组重复3次。P < 0.05为差异有统计学意义。

按照Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒操作书面转染细胞48 h后用倒置荧光显微镜观察，转染组细胞可见绿色荧光蛋白均匀分布于细胞内（图 1）。

图 1(Fig.1)

图 1 转染后HEK293T细胞绿色荧光蛋白表达情况 Fig.1 Expression of green fluorescent protein in the transfected cells (Original magnification: ×100). A: Cell were observed in light filed; B: Transfected after 48 hours.

转染48 h后，收集细胞并提取细胞总蛋白，利用Western blot检测正常HEK293T细胞及敲低Cyr61的HEK293T细胞中Cyr61的表达量。结果显示两组HEK293T细胞中均有Cyr61的表达，Cyr61转染组细胞中Cyr61表达量显著低于对照组（^aP < 0.05，图 2）。

图 2(Fig.2)

图 2 敲低Cyr61后Cyr61蛋白表达变化 Fig.2 Expression of Cyr61 protein in HEK293T cells with Cyr61 knockdown (Mean ± SD, n=3). A: The diagram of primitive protein banding; B: Target protein relative gray value. aP < 0.05.

与对照组相比，AngⅡ干预组的Cyr61mRNA及蛋白表达量均明显升高（^aP < 0.05）。与Cyr61敲低组相比，Cyr61敲低+ AngⅡ组的Cyr61mRNA及蛋白表达量均明显升高（^bP < 0.05，图 3）。而与AngⅡ干预组相比明显降低（^cP < 0.05）。

图 3(Fig.3)

图 3 AngⅡ对HEK293T细胞Cyr61表达的影响 Fig.3 Effect of AngⅡ on Cyr61 expression in HEK293T cells (Mean±SD, n=3). A: Expression of Cyr61 mRNA; B: Western blotting of Cyr61 protein expression; C: Semi-quantitative analysis of Cyr61 protein expression relative to GAPDH. aP < 0.05 vs Control, bP < 0.05 vs Cyr61 doenregulated, cP < 0.05 vs AngⅡ.

与对照组相比，Cyr61敲低组细胞凋亡率明显降低（^aP < 0.05）；Ang Ⅱ干预组的凋亡率明显升高（^bP < 0.05）。Cyr61敲低+AngⅡ组的凋亡率较Cyr61敲低组增高（^bP < 0.05），较AngⅡ组显著降低（^cP < 0.05，图 4）。

图 4(Fig.4)

图 4 敲低Cyr61对AngⅡ诱导的HEK293T细胞凋亡的影响 Fig.4 Effect of Cyr61 knockdown on AngⅡ-induced apoptosis in HEK293T cells (Mean±SD, n=3). aP < 0.05 vs Control, bP < 0.05 vs Cyr61 doenregulated, cP < 0.05 vs AngⅡ.

与对照组相比，Cyr61敲低组Bcl-2蛋白表达量明增高（^aP < 0.05）；AngⅡ干预组的Bcl-2表达量明显降低（^bP < 0.05）。Cyr61敲低+AngⅡ组的Bcl-2表达量较Cyr61敲低组降低（^bP < 0.05），较AngⅡ组显著增高（^cP < 0.05，图 5）

图 5(Fig.5)

图 5 敲低Cyr61对AngⅡ干预下HEK293T细胞Bcl-2表达的影响 Fig.5 Effect of Cyr61 knockdown on Bcl-2 expression in AngⅡtreated HEK293T cells (Mean ± SD, n=3). A: Expression of Bcl-2 mRNA; B: Western blotting of Bcl-2 protein expression; C: Semiquantitative analysis of Bcl-2 protein expression relative to GAPDH. (aP < 0.05 vs Control, bP < 0.05 vs Cyr61 doenregulated, cP < 0.05 vs AngⅡ).

本研究采用一种新的基因编辑技术---CRISPR/Cas9技术来敲低HEK293T细胞Cyr61基因，并用AngⅡ干预HEK293T细胞，利用流式细胞仪检测细胞凋亡，用qRT-PCR及Western blot方法检测细胞Cyr61及Bcl-2的表达变化，从而探索Cyr61在AngⅡ诱导HEK293细胞功能中的改变及作用。结果显示，CRISPR/Cas9KO质粒可以有效地敲低HEK293T细胞Cyr61基因。Cyr61表达量的上调与AngⅡ诱导的HEK293T细胞损伤有关。下调Cyr61的表达可以有效地保护AngⅡ诱导的细胞损伤。

AngⅡ是RAS主要生物活性产物之一，在心血管调节中具有众所周知的作用，是肾脏炎症和纤维化以及血压和肾血流动力学的关键调节因子^[15-17]。AngⅡ在不同的细胞中有着不同的作用，如在血管平滑肌细胞中可以促进其增殖而导致动脉粥样硬化^[18]，相反的，AngⅡ可以诱导足细胞、心肌细胞及脐静脉内皮细胞的凋亡^[19-21]。可见AngⅡ的作用机制十分复杂，深入研究AngⅡ的作用机制对于AngⅡ参与的疾病的预防、诊断与治疗具有极其重要的意义。富含半胱氨酸的蛋白61（Cyr61）又称CCN1，是由内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞产生和分泌细胞外基质的组成部分^[4]。Cyr61通过调节不同的信号通路，在不同的生物过程中发挥重要作用。Cyr61在胚胎发育过程中对心血管发育至关重要，而在成年期，它与炎症、伤口愈合、损伤修复以及纤维化和癌症等相关病理密切关^[22]。近年来研究发现Cyr61参与了系统性红斑狼疮相关性肺动脉高压^[23]、肾缺血-再灌注损伤^[24]、心力衰竭^[25]、冠心病^[26]、心肌损伤^[27]等疾病的发生与发展。另外，Shimura等^[28]研究得出尿Cyr61可能成为结肠癌非侵袭性诊断标准。这些研究结果表明Cyr61与多种疾病的发生相关，可能成为临床相关疾病诊断和治疗的潜在靶点。有几项研究表明，AngⅡ可以通过直接调控Cyr61的表达参与多种疾病的病理发展。Hilfiker等^[29]研究发现，用AngⅡ干预大鼠血管平滑肌细胞后Cyr61的表达明显上调并参与血管平滑肌细胞增殖的调节。Jin等^[30]研究发现AngⅡ可以通过诱导Cyr61的表达诱导血管衰老，这种作用能够被AngⅡ受体-1阻滞剂抑制。Saikawa等^[31]研究表明AngⅡ可以诱导Cyr61的表达参与了胆管癌病理发展。这些研究说明Cyr61可能是AngⅡ的下游信号分子。我们的研究发现，在AngⅡ作用下Cyr61的表达明显升高，因此，我们推测Cyr61也可能参与了AngⅡ诱导的HEK293T细胞损伤过程。为验证这个假说，我们应用AngⅡ干预体外培养的HEK293T细胞，并且观察了敲低Cyr61对AngⅡ诱导的HEK293T细胞凋亡的影响。我们通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果发现，AngⅡ作用48 h后HEK293T细胞凋亡率明显增高，敲低Cyr61后HEK293T细胞凋亡率下降，与对照组及AngⅡ干预组相比差异有统计学意义。上述实验结果说明Cyr61参与了AngⅡ诱导的HEK293T细胞凋亡过程，敲低Cyr61能够有效降低AngⅡ诱导的HEK293T细胞凋亡程度。

细胞存活的调节由Bcl-2家族中抗凋亡因子及促凋亡因子的平衡决定^[32]。所以为了进一步研究Cyr61在AngⅡ诱导HEK293T细胞凋亡的作用机制，本实验进一步观察了敲低Cyr61对HEK293T干预下HEK293T细胞Bcl-2表达的影响。我们研究结果发现AngⅡ作用48 h后HEK293T细胞Bcl-2表达水平明显下调，说明Bcl-2确实参与了AngⅡ诱导的HEK293T细胞凋亡过程，而敲低Cyr61则可以在基因及蛋白水平上调Bcl-2的表达。考虑到Bcl-2作为抗细胞凋亡因子起作用，我们的研究结果表明Cyr61通过Bcl-2途径调节AngⅡ诱导HEK293T细胞的凋亡。

综上所述，Cyr61高表达参与Ang Ⅱ诱导的HEK293T细胞损伤过程，敲低Cyr61能够明显减轻AngⅡ诱导的HEK293T细胞凋亡程度，Cyr61通过Bcl- 2途径调节AngⅡ诱导HEK293T细胞的凋亡。因此，阻断病理状况下Cyr61的高表达可能是治疗AngⅡ相关性疾病的新策略。