2019, Vol. 39
寨卡病毒（ZIKV）是一种黄病毒科病毒，于1947年在乌干达首次被发现并从Zika森林的猴子体内分离，因此命名为Zika virus [1-2]。近年来，科学家们已证实ZIKV感染与胎儿脑部发育异常、神经系统疾病等并发症[3-4]密切相关。由于其导致的严重疾病和快速的传播速度，世界卫生组织于2016年2月将ZIKV疫情升级为全球关注的健康紧急事件[5]，ZIKV迄今已扩散至全球80多个国家。遗憾的是，目前还没有治疗ZIKV感染的疫苗或特效药上市[6]，因此，急需开发抗ZIKV药物。为了广泛筛选抗ZIKV药物，我们需要建立一种高效、简便、特异性高、准确可靠的方法。
目前抗寨卡病毒药物的体外筛选方法主要有以下几种：（1）实时荧光定量PCR法（RT-PCR），采用RT-PCR试剂盒检测病毒基因组或蛋白的表达量[7-8]；（2）MTT法，由于ZIKV感染可能会导致细胞死亡，加入MTT，有活力的细胞才会产生紫色甲臜，用DMSO溶解后检测A570 nm，是一种基于细胞水平的药物活性筛选方法[9-11]；（3）表面等离子共振法（SPR），实时跟踪在天然状态下化合物分子与病毒蛋白的相互作用，是一种基于靶点（分子水平）的高通量药物筛选方法[11]；（4）ELISA方法，用专用的酶标板包被捕获抗体过夜，再加入病毒上清或细胞裂解液（抗原），然后加入二抗，显色，检测A450 nm [12-13]。上述方法中，RT-PCR法与SPR法的检测价格昂贵且SPR对仪器要求高；MTT法的准确性不高（低滴度的ZIKV感染引起的细胞病变不一定会导致细胞死亡）；传统的ELISA方法步骤繁琐，耗时长。本研究拟开发一种基于细胞的ELISA方法直接检测细胞内的ZIKV蛋白的相对表达量。
ZIKV基因组RNA入胞后在内质网经翻译生成多聚蛋白，与此同时，病毒和宿主蛋白酶（NS2B-NS3蛋白酶和信号肽酶）将多聚蛋白裂解成3种结构蛋白：衣壳蛋白、包膜蛋白以及前体膜（prM），和7种非结构（NS）蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）[14-16]。其中，E蛋白是病毒感染和复制的必需蛋白质，介导病毒与细胞相关受体的结合，促进病毒与细胞膜的融合，也是黄病毒感染的主要抗原标志物，可用于开发新型的治疗和诊断工具[17-18]。
在精液淀粉样纤维对ZIKV性传播影响的研究中使用了基于细胞的ELISA方法[19]，但是该方法中应用的一抗是黄病毒属E蛋白的广谱抗体，由于ZIKV与其他黄病毒在基因结构上高度相似[20-21]，可能有交叉反应，导致方法特异性不高。另外，细胞培养板孔中的细胞空隙没有被封闭可能导致背景过高，影响结果准确性。
本研究通过优化基于细胞的ELISA方法，将培养好的细胞固定在96孔板上，增加封闭步骤降低背景值，加入ZIKV抗体与之特异性结合，从而省去了用抗体包被过夜的环节，大大缩短了检测时间，最终建立一种简便快捷、特异性高且准确可靠的药物筛选方法。
1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞株和毒株Vero-143细胞：非洲绿猴肾细胞，由广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所提供，用含10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM细胞培养基培养。
ZIKV毒株：Z16006（GenBank：955589.1）血液分离株（浙江首例），亚洲谱系，由广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所提供，经本科室通过Vero-143细胞扩增，于-80 ℃冰箱保存。
1.1.2 主要试剂DMEM高糖培养基、双抗、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶/EDTA（Gibco）；Zika E蛋白多抗（GTX133314，GeneTex）；辣根过氧化物酶HRP标记的二抗（CST）；二甲亚砜DMSO（Zymed）；甲基纤维素（Sigma）；冰醋酸（天津市大茂化学试剂厂）；多聚甲醛（PFA）（北京雷根生物技术有限公司）；吐温20（广州化学试剂厂）。用于验证方法的木脂素类化合物双细辛酮（代号C1）由石菖蒲植物中分离得到。
1.1.3 实验仪器二级生物安全柜（ESCO）；恒温CO2细胞培养箱（Thermo）；高速离心机（Eppendorf）；酶标仪（Tecan）；-80 ℃冰箱（青岛海尔股份有限公司）；倒置光学显微镜（Zeiss）。
1.2 实验方法 1.2.1 ZIKV病毒感染及加药Vero-143细胞以1×105/mL、每孔100 μL接种于96孔细胞培养平板，培养过夜；次日，弃去旧培养基，细胞用PBS洗涤2次；寨卡病毒稀释至100 TCID50，每孔细胞加入50 μL，感染1 h；吸出病毒接种液，每孔加入200 μL含药维持培养基（含2% FBS、1%双抗的DMEM），每个浓度设置3个复孔，同时设置阴性对照组、仅加病毒的阳性对照组，继续培养96 h。
1.2.2 ELISA法检测ZIKV E蛋白细胞培养物弃上清，用PBS洗涤2次；加入4%多聚甲醛，室温下固定20 min；加入冰冻的无水甲醇，于4 ℃通透细胞5 min；PBS洗涤1次；加入寨卡病毒E蛋白一抗，37 ℃孵育1 h；用洗涤液（含0.3%吐温20）洗涤4次；加入HRP-标记的二抗，37 ℃孵育1 h；洗涤5次，加入TMB底物，室温下避光显色5 min；加入1 mmol/L的硫酸终止反应，用酶标仪检测450 nm处的吸光度值（A450 nm）。
1.2.3 RT-PCR实验检验ELISA方法的准确性Vero-143细胞以2×105/mL、1 mL/孔接种于12孔板，培养过夜；弃去旧培养基，按上述设置空白对照组、病毒对照组、化合物C1处理组，培养72 h后，提取各组细胞总RNA，参照Takara逆转录试剂盒说明书，将mRNA逆转录为cDNA；随后按Promega RT-PCR试剂盒说明书进行RTPCR检测，E引物序列：上游引物GGTGGGACTTGG GTTGATGT，下游引物ATGTCACCAGGCTCCCT TTG；内参基因GADPH引物序列：上游引物TTGCAT CGCCAGCGCATC，下游引物TCGCCCCACTTGAT TTTGGA。根据各组样品的CT值来计算2-ΔΔCт，算出各组样品相对于病毒对照组的RNA水平。
1.2.4 检测ELISA方法的交叉反应性Vero-143细胞以1×105/mL、每孔100 μL接种于96孔细胞培养平板，培养过夜；次日，弃去旧培养基，细胞用PBS洗涤2次；登革病毒、寨卡病毒分别稀释至100 TCID50，每孔细胞加入50 μL，感染1 h；吸出病毒接种液，每孔加入200 μL维持培养基，各设置3个复孔，同时设置阴性对照组，继续培养96 h。使用倒置荧光显微镜拍摄细胞病变情况，接着用已建立的ELISA方法检测登革病毒、寨卡病毒组及阴性对照组的寨卡病毒E蛋白，见1.2.2。
1.3 数据处理实验结果采用Graphpad Prism 5软件进行作图及数据的统计分析，两组间比较采用Student's t检验，多组比较则用One-way ANOVA进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 初步建立的E蛋白ELISA实验方法导致高背景按照1.2.1的方法培养Vero-143细胞并加入寨卡病毒感染细胞，将化合物C1稀释成不同浓度加入培养物中，使其终浓度依次为0、1.25、2.5、5、10 μmol/L，未加病毒和药物的细胞为背景对照。然后按照1.2.2的ELISA步骤检测细胞中E蛋白的表达量（图 1），C1具有抗寨卡病毒活性，但背景对照值太高，导致所有结果都偏高，可能影响结果的准确性，也容易产生假阳性。
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图 1 化合物C1抑制寨卡病毒复制的E蛋白ELISA检测结果 Fig.1 Detection of inhibitory effect of compound C1 on zika virus replication using E protein-based ELISA. **P < 0.01 vs cells only group. |
ELISA实验背景高的可能原因有抗体浓度、封闭液及洗涤液的成分和浓度等，我们初步建立的寨卡病毒E蛋白ELISA方法中，未用到封闭步骤，由于细胞固定于孔板后，孔表面尚有未被占据的空隙，用封闭的方法可以排除后续步骤中干扰物质的再吸附，因此，我们增加了2%的脱脂牛奶封闭的步骤。具体操作如下：吸去甲醇，用PBS洗涤后，加入2%的脱脂牛奶，150 μL/孔，在37 ℃封闭1 h。然后洗涤液洗涤3次。接下来按照1.2.2的方法加入一抗（1：1000稀释），继续完成后续步骤，二抗为1：2000稀释。背景对照组的A450 nm值降低0.22，病毒对照组的值也较封闭前降低0.23（图 2）。
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图 2 2%的脱脂牛奶封闭能降低背景 Fig.2 The background was reduced by blocking with 2% skimmed milk. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs without blocking group. |
接下来，在增加封闭步骤的基础上，我们对一抗、二抗的浓度进行了摸索。首先固定一抗稀释倍数为1：1000，对二抗进行1:500、1：1000、1：2000、1：3000、1：4000稀释，结果如图 3A所示，二抗1：500、1：1000、1：2000稀释，病毒组的A450 nm值较为适宜（0.60~1.00），背景对照值也维持在0.20左右，为了节约抗体成本，二抗稀释倍数定为1：2000。然后也对一抗进行1：500、1：1000、1：2000、1：3000、1：4000稀释，结果如图 3B所示，一抗1：500、1：1000、1：2000稀释时，病毒组的A450 nm值较为适宜（0.60~1.00），背景对照值相差不大，为了节约成本，一抗稀释倍数也确定为1：2000。
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图 3 抗体稀释倍数的确定 Fig.3 Determination of the dilution ratio of antibodies in ELISA. A: Determination of the dilution ratio of the 2nd antibody; B: Determination of the dilution ratio of the 1st antibody. |
在前面的研究中，我们对基于细胞的ELISA方法进行了优化：孵育一抗前增加封闭步骤、E蛋白多抗作2000倍稀释、二抗作2000倍稀释，可大大降低背景，提高方法的准确性。接着我们应用优化后的ELISA方法检验化合物C1的抗寨卡病毒效果。结果发现，化合物C1呈浓度依赖性地抑制寨卡病毒E蛋白的合成（如图 4），优化后的E蛋白ELISA方法能满足检测寨卡病毒的需求，所有检测值都在合理范围内。
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图 4 用ELISA方法检测化合物C1的抗病毒效果 Fig.4 Antiviral effect of C1 detected by ELISA. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs virus only group. |
如前所述，RT-PCR方法是检测寨卡病毒的常用方法，我们最后采用RT-PCR法进一步检验本研究中建立的ELISA法的准确性。寨卡病毒感染细胞后，用浓度梯度的化合物C1持续处理72 h后，提取细胞总RNA，RT-PCR检测细胞内E RNA的合成水平。实验结果如图 5所示，化合物C1浓度依赖抑制E RNA的合成，与ELISA方法的结果基本一致，说明优化后的ELISA方法检测寨卡病毒E蛋白表达水平的结果是准确可靠的，可以作为RT-PCR法的补充或替代方法。
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图 5 RT-PCR法检验ELISA方法的准确性 Fig.5 Validation of the accuracy of ELISA by RT-PCR. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs virus only group. |
寨卡病毒与登革病毒的E蛋白在结构上相似度非常高，在应用ELISA法检测时可能会发生交叉反应。为了考察该ELISA方法的特异性，我们对比了寨卡病毒和登革病毒。如图 6A所示，加入100TCID50的登革病毒和寨卡病毒分别感染细胞96 h，ZIKV组和DENV组的细胞都发生了明显的细胞病变效应（CPE）；相应的ELISA结果如图 6B，ZIKV组的A450 nm达到1.29，而DENV组的A450 nm与阴性对照组（背景）的A450 nm值没有显著性差异，约为0.34。以上结果提示，我们建立的ELISA方法对登革病毒没有交叉反应，对寨卡病毒具有高度特异性。
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图 6 ELISA方法对登革病毒的交叉反应性 Fig.6 Cross reaction of ELISA with dengue virus (Original magnification: × 20). A: Morphology of Vero cells infected with 100TCID50 ZIKV and DENV; B: Cross reaction of ELISA with dengue virus. ***P < 0.001 vs cells only group. |
寨卡病毒并非新兴的病毒，由于寨卡病毒感染与胎儿小头症和睾丸损伤等[11]密切关联，完全超越此前对虫媒黄病毒的固有认识，因此迫切需要用新眼光来研究这个老病毒。目前对于寨卡病毒的检测、诊断方面的技术一般依赖于RT-PCR方法[22-23]。
如前所述，目前抗寨卡病毒药物筛选的方法有RTPCR、MTT、SPR、传统的包被ELISA、基于细胞的细胞病变或抑制噬斑形成等方法[24]。预包被的ELISA方法也是检测寨卡病毒的主要方法之一，检测血清中的寨卡病毒抗体或抗原[11, 25-26]，但目前还没有非包被ELISA方法用于抗寨卡病毒药物筛选的报道。本研究中，我们建立的非包被ELISA方法不仅可用于寨卡病毒的检测，还可以用于抗寨卡病毒药物的体外筛选。非包被ELISA方法，即直接在细胞培养板上操作，省去了传统ELISA法中的抗体包被步骤，既节省时间又节省成本。尤其是当上清液中的病毒滴度不够高时，这种检测胞内病毒的方法便是首选，因为细胞是病毒的主要储库，胞内的病毒量远远高于上清液。
由于培养孔中细胞空隙的存在，部分一抗会与空隙非特异性结合，导致背景过高，容易出现假阳性。为了降低背景，我们在孵育一抗前加入2%脱脂牛奶封闭1 h，结果发现，增加封闭步骤可以在不降低检测准确性的同时显著降低背景。除此之外，一抗、二抗的浓度也是影响背景值的重要因素。接下来，根据抗体说明书推荐的稀释范围，分别对一抗、二抗作1：500、1：1000、1：2000、1：3000、1：4000稀释，考察仅加病毒组、细胞对照组（背景）的A值大小。最终确定较理想的实验条件：增加封闭步骤、一抗1：2000稀释、二抗1：2000稀释。
Vicenti等成功应用qRT-PCR方法检测细胞内E蛋白RNA的表达水平来进行抗寨卡病毒药物筛选[27]。接下来，为了评估优化后的ELISA方法，我们同时将ELISA方法、RT-PCR方法应用于抗寨卡病毒药物筛选，对药物抗病毒效果进行了一致性研究。结果显示，ELISA方法检测到化合物C1能浓度依赖性地抑制寨卡病毒E蛋白的合成，且RT-PCR的结果与ELISA方法的结果基本一致，化合物C1同样浓度依赖性地降低E蛋白RNA的相对表达水平，这充分证实了本研究中优化后的ELISA方法的可靠性。
我们还通过考察该ELISA方法对登革病毒的敏感性，研究该方法对其它黄病毒的交叉反应，在两种病毒对同种细胞产生相当的病变效应的情况下，寨卡病毒组的检测值达到1.29，而登革病毒组的检测值与阴性对照组没有显著性差异，说明该方法与登革病毒不存在交叉反应。另外，我们还分别用小鼠来源的4G2抗血清和NS1单抗建立了相应的非包被ELISA方法（数据未列出），也得到了稳定的结果，这间接说明该ELISA方法的可靠性。因此，本研究建立的ELISA方法可以用于抗寨卡病毒药物筛选或者作为其它筛选方法的补充。
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