2019, Vol. 39
表观遗传参与生命活动多个方面，调节机体发育和细胞分化，与多种疾病的发生发展密切相关[1-3]。组蛋白翻译后修饰是重要的表观遗传特征[4]。染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种研究组蛋白修饰的重要技术，主要包括交联的ChIP（X-ChIP）与非交联的ChIP（N-ChIP）。N-ChIP没有甲醛交联试剂破坏抗原表位，其抗原与抗体的亲和力比交联后的细胞亲和力更高，特异性更强，因此有更好的信噪比[5]。由于组蛋白和DNA结合稳定，可以采用非交联ChIP技术进行检测[6]。
N-ChIP主要过程包括对活性细胞进行裂解，酶切释放出核小体，特异性抗体与核小体组蛋白进行免疫共沉淀得到目的染色质，蛋白经过消化后得到目的DNA [7-8]。ChIP产物可以进行定量PCR检测或者构建二代测序文库进行全基因组检测，得到组蛋白修饰信息[9-11]。非交联ChIP-seq技术原理简单，但是其实验过程存在一些技术难点[7]。针对这些技术难点，本研究致力于对建库方法的优化，解决N-ChIP-seq建库中的一些问题。传统的ChIP建库采用末端修复、接头连接、文库富集的方法。但是传统建库过程步骤繁琐，且建库后测序数据覆盖度存在一定问题[12]。本研究使用一种新的建库方法，即Tn5转座酶片段化法进行N-ChIP的建库，并将两种建库方法进行实验操作流程、库检结果、测序质量的分析比较。
1 材料和方法 1.1 细胞株鼻咽癌细胞株HONE1，包括EBV阳性和阴性两种亚型，是由姚开泰、Ronald Glaser等人建立的低分化鼻咽癌细胞系[13]，由本研究所储存。
1.2 主要试剂和仪器1640培养基、胎牛血清以及青霉素/链霉素双抗、非必需氨基酸购自Gibco。END Prep mix2、DNA纯化磁珠、2 × Phanta Master Mix，TruePrep Index kit v2 for illumina、TruePrep DNALibrary Prep kit v2 for illumina均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自Qiagen；微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease，MNase）购自Worthington；Quick Ligse Kit（NEB）；Protein A/G磁珠（Pierce），蛋白酶K（Invitrogen）。其余粉末均购自Sigma-aldrich。旋转仪（Kylin Bell）、离心机（Eppendorf）、PCR仪（Applied Biosystems）、荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）、Qubit（Invitrogen）。
1.3 主要试剂的配方细胞裂解液的配方为：80 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，10 mmol/L丁酸钠，6 mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2，250 mmol/L蔗糖；MNase酶切缓冲液的配方为：10 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl pH7.5，10 mmol/L丁酸钠，3 mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2，250 mmol/L蔗糖；1×IP稀释缓冲液配方为16.7 mmol/L Tris pH 8.0，1.2 mmol/L EDTA，167 mmol/L NaCl，1.1% TritonX-100，0.01% SDS，10 mmol/L丁酸钠；TSE缓冲液配方为：20 mmol/L Tris-HCl pH8.1，2 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，0.1% SDS，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L丁酸钠；LiCl缓冲液配方为：50 mmol/L Tris PH8.0，0.25 mol/L LiCl，0.5% NP40，0.5%脱氧胆酸钠，10 mmol/L丁酸钠。
1.4 细胞培养及处理将贴壁细胞HONE1培养在RPMI 1640完全培养基中（10%胎牛血清以及1%的非必需氨基酸和1%的青霉素/链霉素双抗），在5% CO2压力条件下，37 ℃的恒温培养箱中培养。待细胞生长密度为约80%时，用细胞刮轻轻将细胞刮下来，用PBS洗1遍，在1500 r/min的转速在4 ℃离心5 min。收集细胞后，用1 mL细胞裂解液在冰上裂解10 min，在2500 r/min的转速在4 ℃离心5 min，弃上清，沉淀为细胞核。
1.5 ChIP样品的准备将细胞核用酶切缓冲液重悬，用微球菌核酸酶（MNase）在37 ℃孵育5 min。加入0.2 mol/L的EDTA/ EGTA混合液终止酶解。产物在12 000 r/min转速下，4 ℃离心5 min，得到释放后的核小体。将酶切后的染色质进行电泳验证，选择合适酶切浓度。在样品中加入IP稀释缓冲液，在最后加入2 μL组蛋白修饰抗体（如H3K4me1、H3K4me3抗体等），样品放于旋转仪上，在4 ℃冰箱里旋转过夜。
1.6 目的染色质的富集与纯化样品置于冰上，加入Protein A/G磁珠，放于旋转仪上，在4 ℃冰箱里旋转4 h。将样品放于磁力架上，放置5 min后，将未结合的上清液移入新的离心管中，放于4 ℃保存。用1 mL冷的1×稀释缓冲液、1×TSE缓冲液、LiCl缓冲液、1×Tris-HCl各洗2遍，弃上清。最后用33 μL的ChIP洗脱缓冲液重悬磁珠，加入1 μL 10 mg/mL蛋白酶K，55 ℃条件下消化1 h。取上清，用33 μL的ChIP洗脱缓冲液洗两遍磁珠并合并上清。严格按照说明书，用DNA纯化试剂盒、Qubit定量检测试剂盒将DNA进行纯化、定量。最终得到30 μL洗脱缓冲液洗脱的DNA样品。
1.7 ChIP文库的富集 1.7.1 传统建库首先进行DNA的末端修复。反应体系为：DNA（2.86 ng/μL）30 μL，END Prep mix 215 μL，ddH2O加至65μL。反应条件为：20℃15min，65℃15min，4 ℃保存。用1.8×DNA纯化磁珠（117 μL）纯化样品，严格按照说明书，用10 μL纯水洗脱，取上清。然后将DNA末端加接头。反应体系为：DNA 10 μL，2×Quick Ligse缓冲液12.5 μL，10 μmol/L Adaptor 1 μL，Quick Ligase 1.5 μL。在常温静置反应15 min；用1×DNA纯化磁珠（25 μL）纯化，最后用23 μL ddH2O洗脱，取上清。进行PCR文库扩增。配制37 μL PCR混合液：2×Phanta Master Mix34.3 μL，10 μmol/L Multiplexing引物1.37 μL，10 μmol/L Multiplexing index1.37 μL。PCR反应体系为：在DNA23 μL，PCR混合液27 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，5个循环；4 ℃保存。将PCR产物置于冰上，用定量PCR仪进行监测反应体系为：PCR产物5 μL，PCR混合液10 μL，20×evagreen 1 μL，ddH2O加至20 μL。反应条件与PCR一致，确定还需要增加的循环数x个。完成PCR反应：95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，x个循环；72 ℃最终延伸5 min；4 ℃保存。用1×DNA纯化磁珠（50 μL）进行纯化，纯化方法按照磁珠说明书进行。用10 μL ddH2O进行洗脱，加入0.5×DNA纯化磁珠（5 μL）进行片段选择，取上清，1×DNA纯化磁珠（15 μL）再次进行纯化，最终用20 μL ddH2O洗脱。最终用Qubit进行文库定量。
1.7.2 Tn5转座酶建库一般得到的DNA浓度较低，用TruePrep DNA Library Prep kit v2 for illumines进行1ng起始DNA量的文库富集。Tn5片段化反应体系：5×TTBL4 μL，DNAxμL，TTE Mix V 15 μL，ddH2O加至20 μL。反应条件：55 ℃ 10 min；10 ℃保存。立即向反应产物中加入5×TS，室温静置5 min终止片段化过程。然后进行文库富集。PCR反应体系：片段化DNA25 μL，5 × TAB 10 μL，N5XX 5 μL，N7XX 5 μL，TAE 1 μL，ddH2O加至50 μL。PCR仪中反应条件：72 ℃ 3 min；98 ℃预变性30 s；98 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；4 ℃保存，将PCR产物置于冰上，进行PCR监测确定循环数后继续进行PCR反应。DNA文库纯化、片段选择、定量与与传统建库方法一致。
1.8 文库质检与测序使用Bioanalyzer检测文库DNA片段的完整性及插入片段大小，用定量PCR对文库DNA拷贝数进行精确定量。文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库混合使用Illumina高通量测序平台（HiSeq）进行双端测序。
1.9 NGS生物信息学分析质量控制软件fastp（version 0.19.6）可以去除原始测序数据（Raw Data）中测序质量低的测序读长（Reads），切掉Reads中的测序接头序列。
用比对软件bowtie2将质量控制之后的数据（Clean Data）比对回参考基因组，去除PCR重复（软件：sambamba），提取比对质量大于30的测序读长（软件：samtools）；将比对到基因组上的测序读长数目标准化为RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）值（软件：deeptools），并得到bigwig文件用于信号峰图可视化（可视化工具：IGV）。
比对后分析包括样本间Reads基因组范围覆盖度的Pearson相关性计算（deeptools工具）；Reads在基因组上显著富集区域的鉴定（Peak Calling）（HOMER工具）；信噪比评估参数FRiP（Fragment Ratio in Peaks）值的计算（软件bedtools，samtools）；以及不同建库方法得到的富集峰区域之间重叠关系的评估（R包ChIPseeker和ChIPpeakAnno）。
2 结果 2.1 MNase酶切验证与浓度选择由于不同类型细胞对MNase的敏感性各异，因此ChIP之前需要选择MNase的最适浓度。我们使用1、2、4、6、8、16 U浓度梯度的MNase切割DNA，电泳检测DNA片段大小。当DNA片段集中在1~2个核小体长度的位置时的酶浓度为适宜。从图 1可以看出，对于HONE1细胞系，8 U的MNase酶切割的DNA片段长度集中在1~2个核小体。
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图 1 MNase酶切测试 Fig.1 MNase digestion test. |
传统ChIP-seq文库的构建，包括末端修复、末端加入接头、文库的富集以及文库片段的选择，而Tn5转座酶建库将目的DNA片段化后直接进行文库的富集（图 2）。在建库过程中，Tn5转座酶建库使用1 ng DNA起始量，需要11~15个PCR循环数；一般传统建库的起始量要求50~200 ng，PCR循环数为15~20个。
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图 2 传统建库（左图）与Tn5片段化建库（右图）策略流程 Fig.2 Diagram illustrating the conventional (left) and Tn5 fragmentation-based (right) strategies for DNA library construction. |
图 3A为传统建库后库检结果，文库大小集中在285 bp或450 bp，这代表了插入片段为一个或者两个核小体DNA片段大小。图 3B中，Tn5片段化建库后的文库主峰在250~500 bp范围内，得到的片段更加均一。
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图 3 传统建库与Tn5片段化建库后H3K4me1ChIP文库质检 Fig.3 Quality assessment of H3K4me1 ChIP libraries constructed by conventional (A) and Tn5 fragmentation-based (B) methods. |
组蛋白修饰的非交联ChIP理论上能得到的DNA片段长度为一个组蛋白上大小（146 bp）。在质量控制过程中，对传统建库和Tn5转座酶建库的H3K4me1 ChIP文库插入片段大小进行分布统计。传统建库文库插入片段长度集中在一个组蛋白大小的位置，含有约30%的片段拖尾（＞300 bp）；Tn5转座酶建库后文库片段大小主要分布在100~150 bp之间，仅9%的片段拖尾（＞300 bp）。两种建库方法得到的DNA片段大小均合理，传统建库得到的插入片段更加集中（图 4）。
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图 4 Fastp插入文库大小分布统计比较 Fig.4 Statistics of fastp library insertion length. A: Conventional library; B: Tn5 transposase library. |
H3K4me1 ChIP实验的目的是为了富集H3K4me1结合的DNA片段，将高通量测序之后得到的Reads比对回参考基因组后，用IGV可视化软件查看信号峰图文件，Reads富集区域就是H3K4me1区域，在图中反映为信号峰图。图 5显示两种建库方式获得的信号富集峰图基本一致。
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图 5 H3K4me1 ChIP-seq Reads覆盖峰图 Fig.5 H3K4me1 ChIP-seq Reads coverage peak map. Peaks shown in the map represent enriched region. |
两种建库方法得到的测序数据用HOMER软件鉴定Reads在基因组上显著富集区域（Peak Calling）。Tn5转座酶建库方法获得99 073个富集峰，传统建库方法获得85 060个富集峰。统计两种建库方法获得的富集峰的重叠关系，有63 897个Peak是两种建库方法共有的，占Tn5建库富集峰总数的64.45%，占传统建库富集峰总数的75.12%（图 6）。
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图 6 传统建库与Tn转座酶建库后文库富集区域Venn图 Fig.6 Venn diagram of library enrichment region with conventional and Tn5 fragmentation-based DNA library construction. |
为评估Tn5转座酶建库的稳定性，用Tn5转座酶方法对H3K4me3 ChIP三次生物学重复文库的建立，并计算3次重复试验得到的Reads在全基因组覆盖度的Pearson相关性系数。结果显示3次生物学重复的pearson相关系数接近1（图 7）；同时IGV可视化局部信号分布峰图显示，Tn5转座酶建库3次生物学重复获得的Reads富集信号峰高度一致（图 8）。MACS2鉴定3次试验Reads覆盖富集区域，计算FRiP值。FRiP值越大，背景越低。Tn5转座酶建库后H3K4me3 ChIP信噪比分别为58.69%、84.19%、73.93%。
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图 7 Tn转座酶建库后H3K4me3 ChIP pearson相关分析 Fig.7 Correlation analysis of H3K4me3 ChIP pearson after Tn5 transposase library construction. |
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图 8 Tn5转座酶建库后H3K4me3 ChIP-seq信号峰图相似性分析 Fig.8 Similarity analysis of H3K4me3 ChIP-seq signal peak map after Tn5 transposase library construction. |
染色质免疫沉淀及其高通量DNA测序（ChIP-seq）是一种有价值且广泛使用的分子生物学技术，用于检测DNA与蛋白质相互作用[14]。许多组蛋白修饰在基因表达调控发挥重要重要[15-16]，非交联ChIP技术可更好地检测基因组内组蛋白修饰的变化[17-18]。目前，下一代染色质高通量测序的广泛应用，为表观遗传学的研究提供了更好的平台[19-20]。ChIP-seq数据质量评估对其应用与表观遗传学研究非常重要[21-22]。目前普遍认证的测序程序具有非常高的质量和可靠性，ChIP-seq数据的质量问题一般出现在实验过程，如抗体特异性和灵敏度，染色质片段化，测序文库的制备过程中应用的PCR扩增轮数以及测序深度等方面直接影响数据的质量[23-25]。染色质免疫共沉淀后产物一般产量非常少[26]，为得到足够的与组蛋白相互作用的DNA的信息量，建库过程在整个实验中非常关键。本研究将传统的建库方法与Tn5转座酶建库方法进行比较，总结Native ChIP-seq建库方法的更优方案。
建库过程中，初始DNA的量、PCR循环数、纯化过程都会影响最终的DNA文库[27]。由于ChIP文库构建是一个特异性富集与组蛋白相互作用的DNA的过程，得到的ChIP产物为1~2个核小体（146 bp/292 bp），加上引物序列120 bp，片段长度符合二代测序要求。ChIP建库中，DNA起始量一般少于50 ng，运用传统建库方法需要更多ChIP产物DNA，而Tn5转座酶建库可以用于1 ng起始DNA的建库。传统建库PCR扩增循环数一般为12~20个，Tn5转座酶建库PCR循环数为11~15个，提示Tn5转座酶建库比传统建库方法因为PCR扩增产生的偏向更小。此外，Tn5转座酶建库将DNA片段化后直接进行富集，操作更加简便，而传统建库中步骤繁琐，在实验操作过程中难免引起DNA的丢失，导致实验失败可能性更高。
二代测序分析主要包括3部分：质量控制，比对，比对后分析[28]。从测序质量上看，Tn5转座酶建库和传统建库有很高的一致性，而且得到富集峰更多。为进一步验证，我们使用另一种组蛋在修饰抗体H3K4me3，用Tn5转座酶建库方法进行N-ChIP-seq三次生物学重复。信噪比（FRiP）是检验数据质量的重要参数。FRiP值越大，富集区域越多，背景越低[29]。数据评估分析显示，生物学重复性良好，FRiP值达到50%~80%，提示Tn5转座酶建库后能得到更多富集峰和更低的背景，这进一步说明Tn5转座酶建库在ChIP-seq技术中的优势。此外，非交联ChIP与交联的ChIP类似，研究报道ChIPmentation用Tn5转座酶建库[30-31]，提示Tn5转座酶建库在ChIP技术的建库中具有优势。与N-ChIP不同，ChIPmentation方法适用于交联的ChIP，其Tn5反应在磁珠上进行，不适用于N-ChIP [32]。本研究Tn5转座酶建库运用于N-ChIP，无需交联，可将DNA直接用Tn5转座酶片段化、富集DNA文库，富集效率更高。
综上所述，本研究中，与传统建库方法相比较，Tn5转座酶建库可以避免繁琐的流程，提高效率，减少实验失败可能。Tn5转座酶进行随机切割，并同时在末端加入接头，更加节约时间，效率更高，摆脱繁琐的建库流程，Tn5转座酶建库可以进行微量DNA的建库，克服了传统建库初始量过低以及后续的DNA丢失、背景高的不足，其技术难度低于传统建库，但测序质量优于传统建库。结果表明Tn5转座酶建库方法适用于ChIP-seq，在简化操作同时可以获得高度可重复结果和好的信噪比。本研究通过将两种二代测序建库方法进行比较，有助于N-ChIP-seq技术的应用及推广，也为不同技术在建库方法的选择上提供参考。
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