2019, Vol. 39
胃癌是我国第2大肿瘤[1]，5年生存率全球仅为10%[2]，其高发病率和高死亡率严重威胁着人类健康，随着诊疗技术的发展，胃癌的发病率和死亡率在一些发达国家有稳步下降的趋势[3]，然而，亚洲仍有很高的发病率[4]，因此，深入探究胃癌的发病机制及新的治疗方法就显得尤为重要。近年来，大量生物标志物已应用于胃癌的早期诊断[5-6]，然而，这些生物标志物并没有被很好的整合，并且，这些生物标志物可在多种肿瘤中被检测到[7-8]，因此，对胃癌诊断和治疗的特异性靶点还需要进行深入的研究。
COL1A1是胶原家族的重要成员，被认为与癌症发生有关，COL1A1的异常表达在多种癌症中均有报道[9-11]。此外，Zang等[12]发现COL1A1在胃癌中存在差异表达，但COL1A1在胃癌中的临床意义仍不清楚。基因表达谱（GEO）数据库为癌症相关基因表达谱的生物信息学挖掘提供了可能[13]。本研究通过生物信息学方法筛选出胃癌芯片数据GSE79973中胃癌组织和正常胃黏膜组织的DEGs，对DEGs进行GO分析和KEGG通路富集分析，然后通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选出Hub基因并验证，同时预测调控COL1A1的miRNAs，旨在为胃癌分子机制的进一步研究提供生物信息学依据，也为我们进行基因个体化治疗提供新的途径。
1 材料和方法 1.1 芯片数据来源本研究从GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库下载基因芯片数据集GSE79973，芯片总共包含20例样本，其中10例正常胃黏膜组织和10例胃腺癌组织样本，其芯片平台是GPL570[HG-U133_Plus_ 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，表达数据为expression profiling by array，种属为Homo sapiens。
1.2 数据处理用GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）[14]在线工具分析胃癌样本与正常样本基因数据。将胃癌组织芯片GSE79973矩阵数据的探针名转化为基因名，对原始数据进行去重等处理后，以|logFC|>2且P < 0.01的标准筛选出DEGs，用SangerBox软件绘制火山图。
1.3 DEGs的富集分析为深入了解这些DEGs，我们用DAVID（the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，http://david.abcc.ncifcrf.gov/）在线分析数据库[15]对DEGs进行GO和KEGG通路富集分析[16-17]，以P < 0.05为差异有统计学意义。
1.4 PPI网络构建和关键基因筛选通过在线分析网站STRING（Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes, https://string-db.org/）[18]得到DEGs的蛋白互作网络，以TSV格式导出，将所得源文件导入Cytoscape[19]进行可视化分析，用插件cytoHubba进行Hub基因分析，选用MCC算法，选取前10个Hub基因。
1.5 PPI功能模块分析为进一步明确胃癌可能的信号通路，我们在进行PPI网络构建后，用Cytoscape软件中MCODE插件对PPI网络进行聚类分析后得到PPI功能模块，然后用DAVID数据库将功能模块中的基因进行KEGG pathway分析。
1.6 关键基因验证分析为进一步验证Hub基因，我们利用GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn）数据库[20]分析Hub基因在胃癌组织和正常组织中的表达水平，并绘制Hub基因的KaplanMeiter生存曲线。
1.7 COL1A1和microRNAs关系预测为了解COL1A1参与胃癌的发生发展机制，我们通过在线数据库Target Scan 7.2（http://www.targetscan.org/）预测与COL1A1相互作用的microRNAs。
1.8 microRNAs在胃癌组织的表达及其与生存预后的关系基于OncomiR数据库（http://www.oncomir.org）分析miRNA在胃癌组织和正常组织中的表达，并对其进行预后分析。
2 结果 2.1 胃癌和正常组织的DEGs通过对基因芯片GSE79973进行数据分析，结果显示有181个DEGs（胃癌组/正常对照组），其中上调基因和下调基因分别为57个和124个（图 1）。
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图 1 差异表达基因火山图 Fig.1 Volcano plot of the differential expressed genes in gastric cancer |
GO可分为生物过程（biological process, BP）、细胞组成（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）。采用DAVID对181个DEGs进行GO和KEGG通路富集分析，结果如表 1所示。DEGs主要涉及细胞黏附、细胞外基质组织、氧化还原过程、胶原蛋白分解代谢、异物的代谢等生物过程，细胞学组成分析显示这些基因大多参与细胞外泌体、细胞外基质、细胞外区等的组成。分子功能的变化主要集中在锌、铁离子结合、相同的蛋白结合、细胞外基质结构组成、肝素结合、氧化还原酶活性、血红素结合、氧气结合等。KEGG通路富集分析表明，差异基因主要涉及PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用、蛋白质消化吸收、化学致癌作用、视黄醇的新陈代谢、细胞色素P450代谢通路、矿物质的吸收、胃酸分泌等。
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表 1 胃癌相关差异表达基因的GO和KEGG通路富集分析 Tab.1 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway of the differentially expressed genes in gastric cancer |
将181个显著差异基因输入STRING数据库中，然后将所得数据导入Cytoscape中，利用插件cytoHubba找出前10个Hub基因，分别为COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL2A1、SERPINH1、COL6A3、COL11A1、COL10A1、COL12A1、COL8A1（图 2）。
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图 2 差异基因编码蛋白质的PPI分析图和关键基因筛选 Fig.2 PPI analysis of the proteins encoded by the differential genes and screening of the key genes. A: PPI network for the DEGs; B: Amplification of the network for PPI associated with COL1A1. |
我们用Cytoscape软件中MCODE插件对PPI网络进行聚类分析后得到不同的PPI功能模块，Score得分最高的模块如图 3所示。然后我们通过DAVID在线分析工具对模块中包含的基因进行KEGG pathway分析，主要涉及蛋白质消化吸收、PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用、血小板激活信号通路（表 2）。
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图 3 功能模块图 Fig.3 Functional module diagram |
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表 2 功能模块内基因的KEGG Pathway分析 Tab.2 KEGG pathway analysis of the genes in the functional modules |
用GEPIA数据库进一步验证分析了10个Hub基因在胃癌组织（408例）和正常组织（211例）的表达水平中的表达情况，发现除了COL2A1在胃癌组织中低表达外，其他9个Hub基因均在胃癌组织中高表达，差异有统计学意义（P < 0.05，图 4）。最后我们用GEPIA数据库绘制了Hub基因高表达胃癌组织和低表达胃癌组织的Kaplan-Meiter生存曲线，结果显示COL1A1、COL4A1、COL12A1高表达的胃癌组织的生存率低于低表达组织，差异具有统计学意义（P < 0.05），与患者不良预后密切相关（图 5）。COL1A1的高表达与不良预后的相关性更加显著。
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图 4 胃癌关键基因在肿瘤组织及正常组织中的表达水平 Fig.4 Expression levels of the key genes in gastric cancer and normal tissues. A: COL1A1 expression level; B: COL4A1expression level; C: COL12A1expression level. *P < 0.05 vs normal tissue. The X axis represents tissue type, T the tumor, and N the normal tissue. The Y axis represents log2(TPM +1). TPM: Number of transcripts per million reads. |
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图 5 关键基因对胃癌患者生存分析的验证结果 Fig.5 Validation of the key genes in survival analysis of the patients with gastric cancer. A: COL1A1 validation result; B: COL4A1 validation result; C: COL12A1validation result. The red line represents the high expression group, and the blue line represents the low expression group. HR: Risk ratio. |
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图 6 COL1A1 mRNA 3'UTR中miR-129-5p结合位点的预测结果 Fig.6 Prediction of miR-129-5p binding sites in COL1A1 mRNA3'UTR. |
用Target Scan数据库预测到miR-129-5p直接与COL1A1 mRNA的3'UTR结合，是COL1A1转录后调节因子（图 5）。
2.7 miR-129-5p在胃癌中的表达水平与生存预后分析经OncomiR数据库检索发现，miR-129-5p在胃癌组织中的表达显著低于正常组织（P=3.32e-05，图 7A）。为分析miR-129-5p与胃癌生存预后之间的关系，我们使用此数据库进一步分析了miR-129-5p在胃癌组织中的表达水平与生存期的关系，结果发现，低表达组生存期时间短于正常组织，但差异不具有统计学意义（P=0.1182，图 7B）。
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图 7 miR-129-5p在胃癌中的表达与其生存预后分析 Fig.7 Expression of miR-129-5p in gastric cancer and analysis of the survival outcomes of the patients. A: Expression of miR-129-5p in gastric cancer (**P < 0.05 vs normal); B: Relationship between miR-129-5p expression level and the survival outcomes. |
胃癌早期诊断具有一定难度，大多数胃癌患者确诊时已是晚期[21]，已失去最佳治疗时机，死亡率一直居高不下。因此，探究新的早期肿瘤生物标志物对胃癌的防治具有一定价值。本研究采用生物信息学方法对GEO数据库中的胃腺癌组织和正常胃黏膜组织的基因芯片数据进行分析。首先比较胃癌组织和正常胃黏膜组织中的基因表达情况，共筛选出181个DEGs（胃癌组/正常对照组），其中上调基因和下调基因分别为57个和124个。为进一步了解DEGs，我们进行了GO和KEGG通路富集分析，DEGs的生物过程主要涉及细胞黏附、氧化还原过程、胶原蛋白分解代谢等，细胞学组成分析显示这些基因大多参与细胞外泌体、细胞外基质、细胞外区等的组成。分子功能的变化主要集中在锌、铁离子结合、相同的蛋白结合、细胞外基质结构组成、肝素结合、氧化还原酶活性、血红素结合、氧气结合等。正常情况下，机体的氧化还原过程处于动态平衡状态，而细胞氧化还原环境持续遭到破坏，则可能导致肿瘤的发生[22]。功能模块分析显示：KEGG通路主要涉及蛋白质消化吸收、PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用、血小板激活信号通路。这与一项胃癌关键基因的生物信息学分析的研究结果相似[23]。PI3K-Akt通路在许多肿瘤中都具有较高的易感性[24]。PI3K-Akt通路通过促进细胞增殖，在肿瘤细胞侵袭、转移中起着重要的作用[25]。
PPI网络筛选出10个Hub基因，由GEPIA验证得知COL1A1（Collagen, type Ⅰ, alpha 1）的高表达与不良预后显著相关，有研究已证实此结果[26]。最近有研究[27]提出了COL1A1可作为胃癌早期筛查的标志。Ⅰ型胶原是纤维胶原家族的主要成分，主要参与细胞外基质结构的组成，被认为是一种肿瘤相关基因[28]，可能参与了肿瘤的侵袭和进展[29]，有研究表明[30]，COL1A1的上调有助于卵巢癌细胞对顺铂耐药。为进一步了解COL1A1参与胃癌发生发展的分子机制，我们预测了调控COL1A1的转录后调节因子miRNAs，miRNA是内源性小型非编码RNA分子，其长度为18-24个核苷酸，可通过诱导mRNA降解或通过与mRNA的3'-UTR的互补结合而抑制mRNA[31]。预测结果显示miR-129-5p可直接与COL1A1 mRNA的3'UTR结合。miR-129-5p是一种有效的肿瘤抑制因子[32-33]，为验证胃癌中miR- 129-5p与COL1A1的关系，我们通过OncomiR数据库检索了miR-129-5p在胃癌中的表达与生存预后，结果显示miR-129-5p在胃癌组织中的表达显著低于正常组织（P=3.32e-05），生存期也短于正常组织。由此得出miR-129-5p调控的COL1A1是胃癌潜在的治疗靶点。这与最近的一项miR-129-5p通过抑制COL1A1来抑制胃癌细胞的侵袭和增殖[34]的研究结果一致。
综上所述，我们通过生物信息学分析确定了差异表达的基因，由富集分析和蛋白互作可知，COL1A1在胃癌中是一种高表达分子。此外，在胃癌中预测到miR- 129-5p可下调COL1A1的表达。COL1A1应该是miR- 129-5p调控胃癌治疗的靶点。为了得到更准确的相关性结果，还需要进行一系列的实验来验证预测结果。
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