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  南方医科大学学报  2019, Vol. 39Issue (4): 471-476  DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.04.14.
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朱建, 杨燕, 胡司淦, 李辉, 张恒. Connexin 43在急性冠脉综合征患者外周血单核细胞中的表达[J]. 南方医科大学学报, 2019, 39(4): 471-476. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.04.14.
ZHU Jian, YANG Yan, HU Sigan, LI Hui, ZHANG Heng. Expression of connexin 43 in peripheral blood monocytes from patients with acute coronary syndrome[J]. Journal of Southern Medical University, 2019, 39(4): 471-476. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.04.14.

基金项目

安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2018A0242, KJ2016A484);蚌埠医学院自然科学基金(BYKY1672)

作者简介

朱建, 硕士, 主治医师, 讲师, E-mail:zhujian660824@sohu.com。

通信作者

张恒, 硕士, 副教授, 主任医师, E-mail:hengzhangbbmc@163.com

文章历史

收稿日期：2018-12-12
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
Connexin 43在急性冠脉综合征患者外周血单核细胞中的表达
朱建 1, 杨燕 2, 胡司淦 1, 李辉 1, 张恒 1     
1. 蚌埠医学院第一附属医院 心内科, 安徽 蚌埠 233000;
2. 蚌埠医学院第一附属医院 肿瘤内科, 安徽 蚌埠 233000
收稿日期：2018-12-12
基金项目：安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2018A0242, KJ2016A484);蚌埠医学院自然科学基金(BYKY1672)
作者简介：朱建, 硕士, 主治医师, 讲师, E-mail:zhujian660824@sohu.com。
通信作者：张恒, 硕士, 副教授, 主任医师, E-mail:hengzhangbbmc@163.com。
摘要: 目的 研究急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单核细胞(PBMCs)上缝隙连接蛋白(Cx) 43的表达变化及意义。方法 选取2018年1月~2018年6月期间入住我科的初诊ACS患者40例, 其中不稳定型心绞痛(UAP)患者20例, 急性心肌梗死(AMI)患者20例, 选取20例同期健康体检者作为对照组。采集所有受试者外周静脉血, 分别提取血浆和单核细胞, 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫比浊法(TIIA)检测血浆中白细胞介素(IL) -1β和高敏C-反应蛋白(hs-CRP)含量, 运用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测PBMCs中Cx43 mRNA和蛋白的表达水平。结果 与对照组相比, UAP组患者外周血浆中IL-1β及hs-CRP的含量均有明显升高(P < 0.001), PBMCs中Cx43 mRNA和蛋白的表达量也显著增高(P < 0.001); AMI组患者外周血浆中IL-1β及hs-CRP的含量较UAP组进一步升高(P < 0.001及P < 0.01);而AMI组患者PBMCs中Cx43 mRNA和蛋白的表达量却较UAP组和对照组均有明显降低(P < 0.05)。结论 UAP和AMI患者体内存在不同程度的炎症激活, 且Cx43在两者PBMCs中的表达量呈现相反的表达变化, 提示Cx43可能在ACS不同类型发病中起到不同效应。
关键词: 不稳定型心绞痛    急性心肌梗死    缝隙连接蛋白43    白细胞介素-1β    高敏C-反应蛋白    
Expression of connexin 43 in peripheral blood monocytes from patients with acute coronary syndrome
ZHU Jian 1, YANG Yan 2, HU Sigan 1, LI Hui 1, ZHANG Heng 1     
1. Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, China;
2. Department of Medical Oncology, First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, China
Abstract: Objective To investigate the expression of connexin 43 (Cx43) in peripheral blood monocytes (PBMCs) from patients with acute coronary syndrome (ACS) and its clinical implications. Methods We prospectively collected the clinical data from 40 patients with ACS including 20 with unstable angina pectoris (UAP) and 20 with acute myocardial infarction (AMI) admitted in our department between January, 2018 and June, 2018, with 20 healthy subjects undergoing routine physical examinations serving as the control group. Peripheral blood samples were obtained from all the participants and plasma and PBMCs were separated. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and turbidimetric inhibition immunoassay (TIIA) were used for analysis of plasma levels of interleukin (IL)-1β and high sensitive C-reactive protein (hs-CRP), respectively; real-time quantitative RT-PCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein levels of Cx43 in the PBMCs. Results Compared with the control group, the patients with UAP showed significantly increased plasma levels of IL-1β and hs-CRP (P < 0.001) and obviously elevated expressions of Cx43 at both mRNA and protein levels in the PBMCs (P < 0.001). Compared with the patients with UAP, the patients with AMI had significantly higher plasma IL-1β and hs-CRP levels (P < 0.001 and P < 0.01) but lower expression levels of Cx43 in the PBMCs (P < 0.05). Conclusion Patients with UAP and AMI have activated inflammatory responses and reverse changes in Cx43 expression in the PBMCs, suggesting the different roles of Cx43 in the pathogenic mechanisms of different types of ACS.
Keywords: unstable angina pectoris    acute myocardial infarction    connexin 43    interleukin-1β    high sensitive C-reactive protein    

急性冠脉综合征(ACS)是冠心病的一种严重类型, 也是临床常见的危重疾病, 主要包括不稳定型心绞痛(UAP)、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)和ST段抬高型心肌梗死(STEMI)。动脉粥样硬化(AS)是冠心病的共同病理改变, 而参与AS的发病机制非常复杂。近年来研究发现, 单核细胞与血管内皮细胞的粘附在AS的炎性发病过程中扮演着重要角色[1]。外周血单核细胞(PBMCs)粘附并活化血管内皮细胞, 同时释放大量炎性介质如C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL) -1β等, 介导局部或全身的慢性炎症反应, 参与AS的发生发展[2-3]。新近研究发现缝隙连接蛋白(Cx) 43在单核细胞与血管内皮细胞粘附这一过程中起重要作用[4], 提示Cx43可能参与AS的发生发展。然而目前关于Cx43与AS的相关性研究虽有报道, 但研究多针对心肌或内皮细胞上该蛋白表达水平的差异, 并且主要聚焦在AS的慢性进展阶段, 对于AS患者外周血单核细胞上, 尤其是AS不稳定或急性发病阶段患者外周血单核细胞上Cx43动态差异的关注较少。因此, 本研究拟以ACS中UAP和急性心肌梗死(AMI)患者为代表, 同时以健康体检非冠心病人群为对照, 检测3组人群血浆中IL-1β和hs-CRP的含量, 在明确UAP和AMI患者存在炎症激活的基础上, 观察3组受试者PBMCs中Cx43 mRNA和蛋白的表达水平变化, 以探讨Cx43与UAP和AMI的相关性并为冠心病的炎性发病机制研究提供新的理论基础。

1 资料和方法 1.1 研究对象

选取2018年1月~2018年6月经门诊或急诊收住院的初诊ACS患者40例, 其中UAP患者20例, AMI患者20例, 以上患者入院后均经冠脉造影证实并成功实施冠脉内支架植入术。同时选取同期健康体检者20例, 均无冠心病病史及心绞痛相关症状, 标记为对照组。UAP诊断参考2011年美国心脏病学会基金会/美国心脏协会(ACCF/AHA)的诊断标准[5]。AMI诊断标准参考2012年ESC的诊断标准[6]。排除标准包括:(1)有明确的恶性肿瘤病史; (2)严重肝肾功能不全; (3)有明确的血液系统疾病; (4)有明确的免疫性疾病等炎性疾病; (5)有明确的甲亢等甲状腺疾病; (6)有其他引起胸痛的原因如肺栓塞、心肌病、主动脉瘤、心脏瓣膜病及充血性心力衰竭等; (7)上呼吸道、肝脏、肾脏等感染性疾病; (8)糖尿病等慢性代谢性疾病。研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准, 入选对象均签署了知情同意书。

1.2 样本制备

清晨或急诊冠脉介入术前采集受试者空腹外周静脉血共约12 mL, 分为10 mL及2 mL两份, 肝素抗凝, 其中10 mmL采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞, 用含2% FBS的PBS洗液洗涤, 悬浮细胞并计数, 取2.0×108单核细胞加入200 μL EasySep抗体正选试剂盒(Stemcell), 用移液器轻轻上下吹打均匀, 室温孵育15 min, 后加入100 μL EasySep纳米磁珠, 充分混匀后室温孵育10 min, 轻轻混匀后将试管放入专用磁极中静置5 min, 将磁极及试管一并取出并弃掉上清。用洗液重新混匀后重复以上过程2次。取约5×105个分选所得的CD14+单核细胞, 加入2.5 μL人CD14-PE抗体(eBioscience), 用抗鼠IgG单克隆抗体做同型对照, 4℃避光孵育30 min, 洗涤后用洗液悬浮细胞, 流式细胞仪检测, 计算CD14阳性率。另一份2 mL外周静脉血经2500×g离心5 min后收集上层血浆, -80℃冻存备用。

1.3 ELISA法检测外周血浆中IL-1β含量

严格按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作, 待检测样品及标准品均为复孔上样, 最后在酶标仪上读取450 nm处吸光值, 求平均值并建立标准曲线, 按照得出的公式计算出对应样品血浆中的IL-1β含量。

1.4 免疫比浊法检测外周血浆中hs-CRP含量

使用Beckman Coulter AU5800型全自动生化分析仪检测血浆中hs-CRP的活性。检测采用免疫比浊法, hs-CRP检测试剂盒为宁波瑞源生物科技有限公司提供。

1.5 RNA提取和qRT-PCR

采用Trizol法提取PBMCs总RNA, 提取后的RNA A260/A280均在1.8~2.0, 取1 μg RNA进行逆转录, 反应条件为:42℃ 1 h, 70℃ 5 min, 获得的cDNA按照试剂盒(TaKaRa)说明进行qRT-PCR反应。反应体系为: SYBR Green PCR Master Mix(2×) 10 μL, cDNA模板2 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, ddH2O 7 μL, 反应总体积为20 μL。反应条件为:95℃预变性3 min, 循环参数95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环, 72℃ 5 min终止反应。引物由上海生工合成, 以人β-actin为内参。Cx43引物序列为5'-GGCG TGAGGAAAGTACCAAA-3 ' (上游), 5'-ACGCCAAG TGATTGAACTCC-3 ' (下游), 产物大小为117 bps; β- actin引物序列为5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT G-3 ' (上游), 5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3 ' (下游), 产物大小为202 bps。qRT-PCR反应结束后取扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳验证目的条带, 扩增结果采用2-ΔΔCt法分析。

1.6 Western blot

提取PBMCs总蛋白, 采用BCA法测定蛋白含量, 每孔取20 μg蛋白95℃变性后上样, 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶100 V、200 mA电泳分离样品蛋白, 转印至PVDF膜, 用脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入Cx43一抗(1:1000, Sigma), 置摇床4℃孵育过夜, 经PBST洗膜3次后加入HRP标记二抗(1:5000, Amersham), 37℃孵育, 室温振摇2 h。洗膜后取5 mL BCIP/NBT显色液(Invitrogen)按照显色试剂说明书进行显色。用Quality图像分析系统对蛋白条带进行灰度分析。β-actin的表达水平作为内参。

1.7 统计学方法

实验结果用均数±标准差表示, 数据使用SPSS 17.0软件进行分析, 统计分析采用单因素方差分析和卡方检验, 各项检测两两比较采用Bonferroni检验, P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般临床资料比较

各组年龄、性别、BMI、吸烟史、单核细胞计数、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、载脂蛋白A、载脂蛋白B、尿酸水平等比较差异无明显统计学意义(P > 0.05);而UAP组和AMI组脂蛋白A较对照组明显升高(P < 0.05); AMI组白细胞计数、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶、肌钙蛋白I较UAP组和对照组明显升高(P < 0.05, 表 1)。

表 1 患者基本临床资料 Tab.1 General clinical data of the patients in different groups (Mean±SD)
2.2 外周血浆IL-1β和hs-CRP水平变化

与对照组相比, UAP组和AMI组患者血浆IL-1β水平升高(P < 0.001);且AMI组较UAP组IL-1β水平进一步升高(P < 0.001, 图 1A)。另外血浆中hs-CRP的含量与IL-1β变化趋势相一致, UAP组和AMI组患者血浆中hs-CRP水平较对照组升高(P < 0.001); AMI组血浆中hs-CRP水平较UAP组明显升高(P < 0.01, 图 1B)。

图 1 各组血浆IL-1β和hs-CRP含量比较 Fig.1 Plasma levels of IL-1β and hs-CRP in each group, **P < 0.01, ***P < 0.001.
2.3 PBMCs的鉴定

外周血单核细胞经CD14-抗体结合珠提纯并经流式鉴定, 结果显示各组CD14阳性细胞数均大于95% (图 2)。

图 2 各组CD14+单核细胞流式鉴定结果 Fig.2 Flow cytometric identification of CD14+ monocytes in each group.
2.4 PBMCs中Cx43的表达

RT-PCR结果显示UAP组Cx43 mRNA表达量较对照组明显升高(P < 0.001)。而AMI组Cx43 mRNA表达量较UAP组降低(P < 0.001), 且表达量低至对照组水平以下(P < 0.05, 图 3A)。此外蛋白表达与基因层面较为一致, 表现为UAP组Cx43蛋白表达量较对照组也明显升高(P < 0.001);但无论与对照组还是UAP组相比, AMI组Cx43蛋白表达量均有不同程度降低(P < 0.001, 图 3B)。

图 3 各组Cx43 mRNA和蛋白表达水平比较 Fig.3 mRNA and protein expression levels of Cx43 in each group, *P < 0.05, ***P < 0.001.
3 讨论

冠心病在我国的发病率正逐年攀升, 并呈现年轻化趋势, 包括慢性冠脉疾病(CAD)和ACS。其中ACS包括UAP和AMI, 是冠状动脉粥样硬化病变急性进展期的临床表现。AS是冠心病共同的病理基础, 近年来越来越多的证据表明AS不仅仅是简单的脂质沉积, 也是一种慢性炎症性疾病, 且炎症参与AS斑块损伤、糜烂破溃、冠状动脉内血栓形成等过程[7]。

既往有临床资料显示, 血清中的炎症介质如hsCRP升高是心血管事件的重要预测因子[8]。此外, 近期一项临床研究显示, 给予AS患者抗IL-1β治疗后, CRP等炎症介质有不同程度降低, 心血管事件明显减少[9]。同时也有研究指出, 循环中的白细胞计数升高的AMI患者30 d及远期死亡风险显著升高, 且容易再发急性心血管事件[10]。而Liang等[11]的研究结果也提示白细胞计数可能是AMI患者冠脉损伤严重程度的独立预测因子。本研究我们发现, 与对照组相比, UAP组患者外周血浆中炎性指标IL-1β和CRP的含量明显升高, 并且在AMI组上述两个指标的表达水平进一步升高。此外, AMI组受试者外周静脉血中白细胞计数较UAP组和对照组均有明显升高。我们的研究结果与这些文献报道结果一致, 共同证实了UAP和AMI患者体内可能处于一定程度的炎症激活状态, 并且其激活程度与疾病的严重程度相关。

研究报道单核细胞与血管壁黏附并移行到内皮下是AS发生的关键步骤[12]。诸多因素与细胞粘附这一起始反应有关, 比如血流动力学的改变, 内皮细胞的损伤等[13-14]。这些因素均可以引起血管内皮细胞上粘附分子的改变, 并与单核细胞表面的受体(如LFA-1、VLA-4)结合后从而促使单核细胞粘附于血管内皮细胞表面[15-16]。单核细胞粘附于血管内皮细胞表面后, 在多种因素的影响下迁移进入内皮下间隙, 被激活后分化成为组织巨噬细胞, 不断吞噬脂质形成泡沫样细胞, 最终形成AS斑块[17]。而Cx43参与循环中单核细胞与血管内皮细胞粘附这一重要过程[4]。该蛋白属于Cx蛋白家族成员, 广泛表达于人体各个系统[18-19], 其异常表达与包括心血管疾病在内的多种疾病的发生发展密切相关[20]。有鉴于此, 本研究旨在探讨与健康对照人群相比, UAP和AMI患者PBMCs上Cx43的表达变化和意义。研究结果发现与对照组比较, Cx43的基因和蛋白表达量在UAP组均有明显增加。这一发现得到既往研究结果的支持。如有资料显示, 在AS发生的早期阶段, Cx43在血管内皮细胞和平滑肌细胞上的表达明显上调, 而其表达的变化影响了单核细胞向血管内膜下的迁移[21-22]。由于Cx43蛋白的C末端与细胞骨架蛋白紧密连接在一起, 因此Cx43表达增加导致迁移进入血管内膜的单核细胞明显增加; 而在单核细胞在分化成为泡沫细胞的过程中, Cx43表达增加也大大加强其吞噬脂质的能力[23]。另外还有报道显示, 纤维帽的稳定性同样与Cx43的表达存在密切联系[24-25]。因此不难推测PBMCs上Cx43的表达增加将可能对AS的恶性进展和转归产生影响。

然而我们还发现一个有趣的现象, 即Cx43在AMI患者PBMCs中的表达量较对照组和UAP组明显降低。而这一变化是否与AMI独特的发病机制有关联, 目前仍不得而知。曾有报道指出, 致炎因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素-γ (IFN-γ)等可以通过c-Jun氨基端激酶途径减少脊髓星形胶质细胞中Cx43的表达[26]。也有研究显示, 心肌细胞在缺血状态下可以通过自噬作用加速Cx43的降解[27]。同时也有学者认为, 特异性阻断Cx43半通道可以有效减少心肌缺血再灌注损伤[28]。这些结果在一定程度上提示Cx43的降低在疾病的某些阶段可能作为一种"保护因素"发挥效应。目前Cx43该表达模式发生的机制尚不明确, 结合本研究结果我们初步推测在AMI急性发作阶段时, 有可能由于机体产生了大量的炎性介质如IL-1β、CRP等, 通过一系列机制导致Cx43的表达减少, 这可能是机体自身的一种保护性机制的体现, 然而这一推测尚需更多研究进一步证实。

综上所述, 本文以UAP和AMI为冠心病典型代表, 通过检测PBMCs中的Cx43和血浆中IL-1β、CRP的表达水平, 证实了ACS患者存在不同程度的炎症激活, 并发现了Cx43在ACS不同类型患者中的表达量不同, 提示其在UAP和AMI发病中可能存在不同的作用或调控机制。未来寻找或设计改变Cx43表达的方法或途径, 可能为冠心病的临床治疗提供新思路及策略。

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