2019, Vol. 39
2. 南京医科大学连云港临床医学院麻醉科，江苏 连云港 222000
2. Department of Anesthesiology, Lianyungang Clinical Medical College of Nanjing Medical University, Lianyungang 222000, China
术后认知功能障碍（POCD），也称为围术期神经认知紊乱，是指患者在接受手术和麻醉后出现的一种中枢神经系统并发症，主要表现为智力降低，记忆力降低，理解力和心理活动受损且持续数周或数月[1-2]，部分患者可发展为永久性认知功能障碍，生活自理能力丧失[3-4]，给患者家庭和社会带来沉重的负担[5-6]。术后认知功能障碍最先发现于心脏术后患者，近年来在骨折术后也有较高的发生率。其发病机制尚不清楚，可能与术后中枢炎症相关。
右美托咪定（Dex）是一种新型α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛、抗交感等作用，可用于临床麻醉及ICU镇静[7]。研究表明右美托咪定能够明显降低老年患者术后POCD发生率[8-10]，但是其作用机制仍不清楚。CX3CL1又称Fractalkine，是趋化因子CX3CL家族成员，是一种抑制性的趋化因子，仅在中枢神经系统中特异性表达，作用于小胶质细胞，与中枢炎症有着密切的关系。在中枢神经系统中，CX3CL1与其受体CX3CR1结合，具有诱导炎症发生的功能，可作为预测脑梗死发生的指标[11]。围术期炎症反应是术后认知功能障碍发生发展的主要机制，IL-6和TNF-α导致中枢炎症[12]在术后认知功能障碍的进展中有重要的作用[13]。此外，腹腔注射LPS制作大鼠急性系统性炎症模型，引起海马炎症反应，导致老年大鼠术后认知功能障碍[14]。本实验通过建立大鼠胫骨骨折术后POCD模型，探讨右美托咪定预处理对术后认知功能障碍的作用，及其与CX3CL1之间的关系。
1 材料和方法 1.1 实验动物选择雄性SD大鼠，22月龄，体质量500~600 g，购于南通大学（许可证号：SCXK（苏）2014-0001），动物实验取得医院伦理委员会批准。
1.2 实验材料盐酸右美托咪定注射液（180528BP，恒瑞）、CX3CL1抗体（Abcam）、CX3CL1引物（上海生工）、CX3CL1中和抗体（R & D SYSTEMS）。
1.3 实验方法 1.3.1 动物模型POCD模型：对大鼠进行七氟烷麻醉，根据大鼠对疼痛的的反应及时追加麻醉剂量，在胫骨中点出切开皮肤，分离皮下组织，用骨剪横向剪断胫骨，随后放置髓内钉固定，逐层缝合。实验分为3个阶段，第1阶段：选择16只雄性SD大鼠，随机分为两组，每组8只，其中一组为对照组，不进行胫骨骨折处理，另一组为胫骨骨折组。对照组与胫骨骨折组大鼠均行七氟烷麻醉，麻醉剂量与麻醉时间相同。于胫骨骨折手术造模前，造模后1、3、5、7 d分别测定两组大鼠认知行为学指标，测定对照组麻醉后当天及胫骨骨折组1、3、5、7 d时海马区CX3CL1蛋白及CX3CL1 mRNA的表达变化。第2阶段：选择24只雄性SD大鼠，随机分为对照组、胫骨骨折组和胫骨骨折+CX3CL1中和抗体组，每组8只大鼠。其中对照组与胫骨骨折组及胫骨骨折+CX3CL1中和抗体组大鼠均行七氟烷麻醉，麻醉剂量与麻醉时间相同，胫骨骨折+CX3CL1中和抗体组于造模前给予大鼠侧脑室CX3CL1中和抗体1 pmol。于术后第3天取大鼠海马组织，分别测定各组大鼠行为学指标及海马区CX3CL1蛋白的表达变化。第3阶段：选择24只雄性SD大鼠，随机分为对照组、胫骨骨折组及胫骨骨折+ Dex组，每组8只大鼠。对照组与胫骨骨折组及胫骨骨折+ Dex组大鼠均行七氟烷麻醉，麻醉剂量与麻醉时间相同，胫骨骨折+Dex组于造模前给予大鼠腹腔40 μg/kg右美托咪定。于术后第3天取大鼠海马组织，分别测定各组大鼠行为学指标及海马区CX3CL1蛋白和CX3CL1mRNA的表达变化。
1.3.2 新异臂探索实验本实验采用Y迷宫评价大鼠的认知功能。Y迷宫有3个相同的臂（长方体空间）组成，每一个臂之间的夹角为120°。第1步：关闭其中一个臂，让大鼠在另外两份臂中探索10 min。第2步：第1步完成后45 min，让大鼠探索3个臂5 min。分别记录大鼠在每个臂中的活动时间。探索共进行3次。新异臂（一开始关闭的）探索时间百分比=新异臂探索时间/探索总时间。
1.3.3 Western blot测定CX3CL1蛋白的表达实验的第1阶段与第2阶段的大鼠进行认知行为学测试后，立刻10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg，腹腔注射），取出海马，迅速液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存。组织加入裂解液后进行匀浆。4 ℃离心，收集上清。在SDS-聚丙酰胺凝胶上上样，电泳，转膜。5%BSA室温封闭2 h，漂洗，加入CX3CL1一抗4 ℃过夜，漂洗3次，加入二抗室温摇床2 h。最后，浸泡ECL工作液后化学显影并拍照。
1.3.4 RT-PCR半定量测定CX3CL1mRNA使用RNAsimple Total RNA试剂盒提取大鼠海马总RNA，使用TIANScript RT试剂盒进行反转录，琼脂糖凝胶电泳进行GAPDH和CX3CL1的cDNA扩增，紫外透射下进行拍照。所使用引物由上海生工合成，CX3CL1上游引物：5'-CCCTGAGACACCCGTTTC-3'，下游引物：5'- AGTGACTATTCATGTTGATAAGGG-3'。GAPDH上游引物：5'-TTCCAGGAGCG-AGATCCC-3'，下游引物：5'-CAGGGGGGCTAAGCAGTT-3'。
1.4 统计学处理采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，并生成统计图表。所有计量资料均用均数±标准差表示。多组比较采用方差分析，方差分析后的两两比较采用q检验。P < 0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 造模后大鼠认知功能的变化手术前两组新异臂探索时间相同。造模后与对照组相比，胫骨骨折造模组大鼠在术后第1、3、5、7天新异臂探索时间明显减少（P < 0.05），差异有统计学意义；与造模前0 d相比，造模组大鼠在术后第1、3、5、7天新异臂探索时间减少（P < 0.05，图 1）。
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图 1 造模后大鼠新异臂探索时间的变化 Fig.1 Time spent in the novel arm of rats after tibial fracture surgery (*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05, vs 0 day). |
提取大鼠海马区CX3CL1蛋白，与对照组相比，造模组大鼠海马区CX3CL1蛋白表达明显降低（图 2）；CX3CL1mRNA的表达也明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05，图 2）。
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图 2 造模后大鼠海马区CX3CL1蛋白和CX3CL1mRNA的表达变化 Fig.2 Quantification of CX3CL1 protein and mRNAexpressions after tibial fracture surgery (*P < 0.05 vs control group). |
对照组、模型组和模型+CX3CL1中和抗体组在手术前的新异臂探索时间相同。造模后，与对照组和模型组相比，给予CX3CL1中和抗体后大鼠新异臂探索时间减少，差异有统计学意义（P < 0.05，图 3）。
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图 3 模型组给予CX3CL1中和抗体后新异臂探索时间的改变 Fig.3 Changes in the time spent in the novel arm in rats with tibial fracture treated with CX3CL1 antibody (*P < 0.05 vs surgery group; #P < 0.05 vs 0 day). |
模型组大鼠给予CX3CL1中和抗体后，大鼠海马区CX3CL1蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05，图 4）。
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图 4 给予CX3CL1中和抗体后大鼠海马CX3CL1蛋白的表达变化 Fig.4 Quantfication of hippocampal CX3CL1 protein expression in rats with tibial fracture and CX3CL1 antibody treatment (*P < 0.05 vs surgery group). |
对照组、模型组及模型+Dex组在手术前的新异臂探索时间相同。造模后，与模型组相比，给予右美托咪定（Dex）后大鼠新异臂探索时间增加，差异有统计学意义（P < 0.05，图 5）。模型组+DEX组与第0天相比，第1、3、5、7天新异臂探索时间降低（P < 0.05）。
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图 5 模型组给予右美托咪定后新异臂探索时间的改变 Fig.5 Changes in the time spent in the novel arm in rats with tibial fracture and Dex treatment.*P < 0.05 vs surgery group; #P < 0.05 vs 0 day. |
模型组大鼠给予右美托咪定后，海马区CX3CL1蛋白和CX3CL1mRNA的表达增加，差异有统计学意义（P < 0.05，图 6）。
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图 6 给予右美托咪定后大鼠海马区CX3CL1蛋白和CX3CL1mRNA的表达变化 Fig.6 Quantification of hippocampal CX3CL1 protein and mRNA expressions in rats with tibial fracture and Dex treatment.*P < 0.05 vs surgery group. |
术后认知功能障碍的发生与很多因素有关，而其中中枢炎症与POCD之间的关系最为密切[15]，研究也最为广泛。研究表明，外周炎症因子可以通过一定的途径进入中枢神经系统，特别是海马，损害突出的可塑性，最终导致POCD[16]。此外，外科手术导致炎性细胞因子增多，引起神经炎症，促使脑功能改变，最终导致术后认知功能障碍[17]。此外，动物实验证明外科手术触发IL-β介导的海马炎症是记忆障碍的基础[18]。Li等通过抑制P38丝裂酶原活化蛋白激酶减轻海马区炎症，可以改善小鼠术后认知功能障碍[19]，此外，抑制海马区氧化应激也能改善老年动物术后认知功能障碍[20]。
本研究发现右美托咪定腹腔注射可明显减轻骨折手术所致的大鼠术后认知功能障碍，同时提高大鼠海马CX3CL1蛋白及CX3CL1mRNA的表达。本实验采用新异臂探索实验作为模型[21]，根据前期的研究选择右美托咪定的干预剂量。右美托咪定作为一种强效的肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛、抗焦虑、抗寒颤等作用，且无呼吸抑制[22]。预防给予右美托咪定能够显著降低非心脏手术病人术后POCD的发生率[23]，其改善POCD的机制可能与其抑制炎症反应有关。脾切除手术能够引起小鼠海马炎症反应，导致术后认知功能障碍，而右美托咪定能够改善此小鼠的术后认知功能障碍[24]。此外，临床研究也表明右美托咪定能够通过降低炎症因子如IL-6、TNF-α和C反应蛋白减少早期POCD的发生[25-26]，与本实验研究结果相似。本实验研究发现胫骨骨折手术可以对大鼠产生明显的认知功能损伤，致其新异臂探索时间减少；而给与右美托咪定提前干预可明显缓解其认知功能受损状况。
CX3CL1是趋化因子CX3CL家族的成员，是一种抑制性的信号趋化因子，在中枢神经系统表达，由神经元产生[27]，其唯一受体CX3CR1表达于小胶质细胞表面。CX3CL1与中枢炎症有着密切的关系，CX3CL1在中枢神经系统的发育和成熟中有很重要的作用，并且维持神经系统的正常活动。研究表明CX3CL1在神经系统的损伤、炎症应答及修复过程中起着重要的作用。它通过调节小胶质细胞的功能，减少炎症因子的释放等机制起到神经保护的作用[28]。中枢神经系统内的CX3CL1可能通过影响小胶质细胞和神经元之间的信息传递从而引起小胶质细胞的炎症反应进而参与了阿尔茨海默病的发病[29]。我们发现大鼠给与胫骨骨折手术后，海马区内CX3CL1蛋白和CX3CL1 mRNA的表达明显低于正常组，表明胫骨骨折手术导致POCD后，中枢内CX3CL1表达明显下降。
为了进一步证实大鼠术后认知功能障碍的发生是通过中枢CX3CL1表达的下降起作用的，我们在模型组大鼠侧脑室给予CX3CL1中和抗体。结果发现在模型组大鼠侧脑室给予CX3CL1中和抗体后，与模型组相比，大鼠在新异臂的探索时间进一步降低，说明大鼠术后认知功能障碍加重了；同时我们测得模型组大鼠侧脑室给予CX3CL1中和抗体后，与模型组相比，大鼠海马区CX3CL1蛋白的表达进一步降低。由此判断，大鼠术后认知功能障碍的加重与大鼠海马区CX3CL1表达的进一步下降有关。
对模型组大鼠于造模前给予一定剂量的右美托咪定预处理，大鼠海马区CX3CL1蛋白和CX3CL1 mRNA的表达明显升高，大鼠新异臂探索时间也明显延长，说明改善了大鼠的术后认知功能。这可能与右美托咪定提高CX3CL1的基因表达，从而降低下游的NF-κB依赖的促炎性因子相关[30]。
本研究发现右美托咪定改善POCD的作用机制可能与调控中枢CX3CL1的表达有关，这对于我们重新认识右美托咪定这一药物，并将其更好地用于临床，预防患者术后认知功能障碍的发生，具有重大意义。我们还将通过后续的实验进一步证实右美托咪定改善POCD的机制与调控中枢CX3CL1表达之间的关联。
综上所述，右美托咪定可能通过提高大鼠海马区CX3CL1的表达改善术后认知功能障碍。
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