2019, Vol. 39
2. 华南理工大学医学院，广东 广州 510005
2. School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510005, China
黑素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，目前的治疗方法一般采用手术、化疗、放疗。虽然传统方法能在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长，但存在显著的副作用且患者的生存率仍然较低[1-2]。因此探究新的肿瘤治疗方法显得尤为必要。
毫米波是一种频率为30~300 GHz，波长为1~10 mm的电磁场。研究表明毫米波辐照生物体可以产生多种生物学效应[3-5]。利用这种生物学效应，毫米波作为一种治疗手段被应用于多种疾病的临床治疗中，如关节炎、皮肤损伤、十二指肠溃疡、肌肉劳损等[6]。此外，有研究发现毫米波辐照对肿瘤细胞生长具有抑制作用[7-13]，但由于毫米波具有频率高波长短的特性，辐照过程中各种介质如培养皿、培养液等对辐照能量分布的影响较大[14]，实际辐照中不同部位的细胞接收到的能量（用比吸收率（SAR）来表示[15]）可能会与给出的入射毫米波参数相差较大，造成类似实验结果重复性差，因此相关结论一直存在争议。针对这一问题，本文拟在实验设计中增加细胞中SAR的研究，对比分析并得到最佳辐照参数，之后研究毫米波辐照对人黑素瘤A375细胞凋亡的影响及相关机制。
1 材料和方法 1.1 材料DMEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液等（Gibco），细胞活性检测试剂盒（Dojindo），Annexin V/PI凋亡检测（BD Biosciences），Caspase-3、β-actin抗体（Cell Signaling Technology），全自动酶标仪（Bio-Tek），二氧化碳细胞培养箱（SANYO），增强化学发光试剂盒（Millypore），Caspase-3抑制剂AC-DEVD-fmk（凯基生物），毫米波辐照系统KFA-100A（北京中成康富有限公司）。人黑素瘤细胞株A375来源于中国科学院细胞库并培养于南方医科大学临床医学实验研究中心。
1.2 方法 1.2.1 电磁计算实验 1.2.1.1 FDTD算法原理细胞的SAR通过电磁场的时域有限差分（FDTD）计算得到[16]，算法基于的麦克斯韦旋度方程如下：
| $ \nabla \times E = - \mu \frac{{\partial H}}{{\partial t}} $ | (1) |
| $ \nabla \times H = - \sigma {\rm{ E}} + \varepsilon \frac{{\partial E}}{{\partial t}} $ | (2) |
其中E和H分别表示电场和磁场强度，μ 、σ、ε分别为介质的磁导率、电导率和介电常数。
在FDTD算法中，计算域内的毫米波电场与磁场被网格离散化，划分电场的网格称为电网格，划分磁场的网格称为磁网格，其中电网格为主要网格，磁网格为次要网格。在时域及空间域使用等间隔二阶有限差分法可使式（1）（2）旋度方程离散化，令
| $ \frac{{\partial F(i, j, k, n)}}{{\partial x}} = \frac{{{F^n}\left( {i + \frac{1}{2}, j, k} \right) - {F^n}\left( {i - \frac{1}{2}, j, k} \right)}}{{\Delta x}} + O[{(\Delta x)^2}] $ | (3) |
| $ \frac{{\partial F(i, j, k, n)}}{{\partial t}} = \frac{{{F^{n + 1/2}}\left( {i, j, k} \right) - {F^{n - 1/2}}\left( {i, j, k} \right)}}{{\Delta t}} + O[{(\Delta t)^2}] $ | (4) |
其中Fn是在n·∆t时刻的电场E的分量
| $ \begin{array}{l} \frac{{{E_x}|_{i, j, k}^{n + 1} - {E_x}|_{i, j, k}^n}}{{\Delta t}} = \frac{1}{{{\varepsilon _{i, j, k}}}}\left( {} \right.\frac{{{H_z}|_{i, j + \frac{1}{2}, k}^{n + \frac{1}{2}} - {H_z}|_{i, j - \frac{1}{2}, k}^{n + \frac{1}{2}}}}{{\Delta y}} - \\ \frac{{{H_y}|_{i, j, k + \frac{1}{2}}^{n + \frac{1}{2}} - {H_y}|_{i, j, k - \frac{1}{2}}^{n + \frac{1}{2}}}}{{\Delta z}} - {\sigma _{i, j, k}}{E_x}|_{i, j, k}^{n + \frac{1}{2}}\left. {} \right) \end{array} $ | (5) |
上式中利用平均近似可以简化为：
| $ \begin{array}{l} {E_x}|_{i, j, k}^{n + 1} = \left( {\frac{{1{\rm{ }} - \frac{{\Delta t{\sigma _{i, j, k}}}}{{2{\varepsilon _{i, j, k}}}}}}{{1{\rm{ + }}\frac{{\Delta t{\sigma _{i, j, k}}}}{{2{\varepsilon _{i, j, k}}}}}}} \right){E_x}|_{i, j, k}^n + \\ \left( {\frac{{\frac{{\Delta t}}{{{\varepsilon _{i, j, k}}}}}}{{1{\rm{ + }}\frac{{\Delta t{\sigma _{i, j, k}}}}{{{\varepsilon _{i, j, k}}}}}}} \right)\left( {\frac{{{H_z}|_{i, j + \frac{1}{2}, k}^{n + \frac{1}{2}} - {H_z}|_{i, j - \frac{1}{2}, k}^{n + \frac{1}{2}}}}{{\Delta y}} - \frac{{{H_y}|_{i, j, k + \frac{1}{2}}^{n + \frac{1}{2}} - {H_y}|_{i, j, k - \frac{1}{2}}^{n + \frac{1}{2}}}}{{\Delta z}}} \right) \end{array} $ | (6) |
同理可以得到其他分量
为了计算实际辐照中不同部位的细胞接收到的能量分布，我们考虑到了细胞培养液在培养皿中形成的弯液面。根据L.D.Angulo等人给出的弯液面高度计算公式（7）[17]，
| $ {{\rm{h}}_{\rm{m}}}\left( {\rm{r}} \right) = {\rm{h}} + 2.51({e^{\frac{{ - {R_0} - r}}{c}}} + {e^{\frac{{ - {R_0} + r}}{c}}} - {2^{\frac{{ - {R_0}}}{c}}}), |r| \le {R_0} $ | (7) |
公式（7）中r表示在培养皿同一直径上的某点距离圆心的距离；R0是培养皿底部半径，其中35 mm培养皿底部半径为16.9 mm；c为衰减系数，其值为2.01；h是培养皿底部圆心所对应的培养液高度，取h=3 mm。使用MATLAB绘制35 mm培养皿弯液面的高度，得到弯液面曲线。根据脚本文件及辐照设备参数利用AutoCAD分别对培养皿及天线进行3D建模，并导入SEMCAD软件中，建模结果如图 1。
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图 1 辐照系统的3D建模图及尺寸图 Fig.1 3D modeling diagrams and dimensioned drawing. A: 3D modeling graphics of the irradiation system and Petri dish (antenna placed below the Petri dish); B: 3D modeling graphics of the irradiation system and petri dish (antenna placed above the Petri dish); C: Partial magnification of the Petri dish in A. The red layer at the bottom represents the cell layer, and the grey area represents the culture medium; D:Sizes of the Petri dish, cell layer and culture medium (mm). |
由于本实验重点关注细胞层吸收的辐照能量且为加快运算速度及减少计算机的内存，因此在细胞层中设置的网格尺寸较为精细，边长δ=0.165 mm，其他部位的网格边长设置为δ=1.299 mm。计算中用到的FDTD算法涉及到的电磁参数如表 1。
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表 1 各种相关材料的相对介电常数，电导率和密度 Tab.1 Relative dielectric constant, conductivity and density of different materials |
由于FDTD算法只能于有限的区域中进行计算，为了能够模拟实际中出现的电磁散射过程，在计算区域的边界处须给出吸收边界条件，本实验中计算区域边界上采用单轴完全匹配的吸收边界条件[18]。
计算中根据培养皿材质和辐照天线的位置设置四组实验：塑料培养皿（天线置于上方、下方）、玻璃培养皿（天线置于上方、下方）。天线相关电参数按照产品说明书设定，其可产生频率为35.2 GHz，波形为正弦波的毫米波电磁场。如图 1所示，电磁计算需要的模型主要包括培养皿及辐照天线。35 mm培养皿底部覆盖着细胞层（红色），灰色表示细胞培养液。细胞层中每个网格单元（i, j, k）内的SAR计算公式如下所示：
| $ \begin{array}{l} {\rm{SA}}{{\rm{R}}^{\rm{n}}}(i, j, k) = \\ \frac{{\sigma (i, j, k)\{ {{[En{\rm{ }}x(i, j, k)]}^2} + {{[E_y^n(i, j, k)]}^2} + {{[E_z^n(i, j, k)]}^2}\} }}{{\rho (i, j, k)}} \end{array} $ | (8) |
式中ρ表示细胞的质量密度。根据公式（8）则可以计算出细胞层的平均SAR。
1.2.2 细胞培养人黑素瘤细胞株A375采用含有10%胎牛血清、100 µ/mL青霉素、100 µ/mL链霉素的DMEM培养液培养，恒温培养箱的培养环境为5% CO2，37 ℃。当细胞生长密度达到80%以上时进行消化传代，实验均在细胞处于生长对数期（通过绘制细胞生长曲线得到细胞进入生长对数期的时间）时开始。
1.2.3 毫米波辐照对数期A375细胞随机分为3组：非辐照组、辐照组及AC-DEVD-fmk组。辐照组中毫米波分别辐照15、30、60、90 min，非辐照组除了不接受辐照其他实验环境均与辐照组一致，AC-DEVD-fmk组在毫米波辐照90 min前以10 μmoL的AC-DEVD-fmk预处理1 h。同时，实验中将热电偶插入培养液中测量辐照过程中温度的变化，结果表明整个辐照过程中温度没有明显的变化。活性及凋亡检测实验均进行3次。
1.2.4 细胞活性检测将A375细胞消化成细胞悬液，以每孔5×103细胞接种到96孔板中，培养24 h后的细胞活性用CCK-8试剂盒来检测。首先，在每孔中加入10 µL CCK-8溶液，之后在恒温培养箱中培养2 h待检测。酶标仪测定处每孔的吸光度值（A450 nm），并利用以下计算公式得到两组的细胞活性比：
| $ \begin{array}{l} 细胞活性比 = \left( {{A_{450{\rm{ nm}}辐照}} - {A_{450{\rm{ nm}}空白}}}~~ \right)/\\ \left( {{A_{450{\rm{ nm}}非辐照}} - {A_{450{\rm{ nm}}空白}}}~~ \right) \end{array} $ | (9) |
公式中A450 nm辐照和A450 nm非辐照分别表示辐照组与非辐照组的A450 nm值，A450 nm空白表示只有完全培养液不含细胞的孔的A450 nm值。当细胞活性比低于100%说明35.2 GHz辐照使A375细胞活性降低。
1.2.5 细胞凋亡检测将A375细胞消化离心，每管加入500 μL Binding buffer重悬细胞。在细胞悬液中加入5 μL Annexin V- FITC并混匀后，再加入5 μL Propidium Iodide混匀，室温避光反应15 min，在1 h之内使用流式细胞仪检测凋亡情况。
1.2.6 Caspase-3活性检测A375细胞样本中加入RIPA裂解液, 冰上裂解30 min，然后在预冷的4 ℃ 13 000 g离心机中离心5 min，收集上清液。利用BCA方法测定上清液中蛋白的浓度，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）分离纯化、转膜、封闭，加入caspase-3一抗，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗后，利用增强化学发光试剂盒（ECL）显影，内参为β-actin。结果以蛋白相对表达量表示=目的条带灰度/内参条带灰度× 100% [22]。
1.2.7 Caspase-3抑制剂对毫米波辐照抑制A375细胞活性干预作用研究按说明书在A375细胞中加入caspase-3抑制剂AC-DEVD-fmk（10 μmol），预处理1 h后，辐照90 min，设置5个复孔，之后按照1.2.4方法检测细胞活性。
1.2.8 统计学处理数据处理采用SPSS 20.0统计软件，数据由均值±标准差表示，组间采用单因素方差分析，当P < 0.05时表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 电磁计算结果4组实验中细胞层的SAR分布如图 2所示。图 3显示的是细胞层中SAR值与培养皿半径关系曲线图。结合图 2，3发现，相同的辐照方式，如图 2A，B，培养于塑料培养皿的细胞层的SAR值分布较均匀，但差异并不是很明显；相同的培养皿材质，如图 2A和图 2C，锥形天线置于培养皿上方时细胞层的SAR出现较多冷热点，即处于同一层面不同位置细胞的SAR差异较大。而在研究毫米波对肿瘤细胞的影响时应尽量避免这种情况的出现，应使同一层面细胞的SAR尽可能均匀。
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图 2 距离培养皿底部0.25 mm层面的SAR分布图 Fig.2 SAR distribution at 0.25 mm from the bottom of the Petri dish. A: Plastic Petri dish with antenna placed below; B: Vitreous Petri dish with antenna placed below; C: Plastic Petri dish with antenna placed above; D: Vitreous Petri dish with antenna placed above. |
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图 3 4组实验中SAR与半径的关系 Fig.3 Relationship between SAR and radius in the 4 experiments. y1: Plastic Petri dish with antenna placed below; y2: Plastic Petri dish with antenna placed above; y3: Vitreous Petri dish with antenna placed below; y4: Vitreous Petri dish with antenna placed above. |
A375接受辐照后在设定的时间点利用CCK-8测细胞活性情况。说明35.2 GHz毫米波辐照A375细胞时可以显著抑制细胞的增殖能力（P < 0.05）。且随着辐照时间的增加，细胞活性逐渐降低，当细胞辐照90 min后细胞的活性达到最低（图 4）。
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图 4 A375细胞接受不同时间辐照后的细胞活性 Fig.4 Cell viability of A375 cells after exposure for different lengths of time. *P < 0.05 vs non-irradiation group. |
毫米波辐照可以诱导黑素瘤A375细胞凋亡，随着辐照时间的增加，细胞凋亡率呈升高趋势，A375细胞分别接受辐照15、30、60、90 min后，凋亡的细胞百分比分别为（7.35 ± 0.21）%、（7.86 ± 0.24）%、（9.87 ± 0.35）%、（11.15±0.24）%，与对照组（3.51±0.25）%相比，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 5）。
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图 5 Annexin V-FITC/PI检测A375细胞接受不同时间辐照后的细胞凋亡率 Fig.5 Flow cytometric analysis with Annexin V-FITC/PI staining for detecting cell apoptosis following the exposures. A: Control cells without exposure; B-E: Cells exposed to MMW for 15, 30, 60, and 90 min, respectively. |
A375细胞经不同时间的毫米波辐照后，Western blot检测结果如图 6显示，随着辐照时间的增加，与非辐照组（0 min）中细胞的caspase-3相比(蛋白相对表达量为1.01±0.08)，辐照组的caspase-3表达成明显上升趋势，辐照90 min时达到最大（蛋白相对表达量为2.52± 0.03）（P < 0.05）。
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图 6 A375细胞辐照不同时间点后Western blot检测结果 Fig.6 Western blotting of caspase- 3 expression in the cells following the exposures. |
CCK-8细胞活性检测显示，加入caspase-3抑制剂AC-DEVD-fmk预处理后，A375细胞的活性率由（36.7± 0.09）%增加到（59.8±0.06）%（P < 0.05）。
3 讨论本研究发现，毫米波辐照对人黑素瘤A375细胞的活性有明显的抑制作用（P < 0.05），这种抑制作用具有时间累积效应。而在Beneduci [7-8]的研究中同样得到毫米波辐照可以抑制RPMI 7932及K562细胞的活性。
细胞凋亡是I型程序性细胞死亡，是由多种分子参与的复杂过程，而caspase-3是主要的凋亡执行者，激活caspase-3可以使细胞发生凋亡[24-27]。研究表明，大部分的肿瘤治疗方法是通过诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制细胞的增殖[28-29]。本文中AV/PI及Western blot结果表明，35.2 GHz毫米波辐照可以引起A375细胞凋亡，且随着辐照时间的增加，caspase-3的表达量明显升高。应用AC-DEVD-fmk后，可以逆转毫米波对细胞活性的抑制作用。因此根据电磁计算实验得到的结果，我们在研究毫米波对A375细胞凋亡的影响时使用塑料培养皿，并将天线置于培养皿下方形成向上的辐照，这一结论与以往文献中使用的辐照方法吻合[13, 23]。
尽管有研究表明毫米波可以抑制体外肿瘤细胞的活性，但由于结果可重复性差，导致这一结论仍然存在争议。除可能无法完全保证两种辐照环境的一致性[30]，细胞的SAR是否一致也可能会是导致低重复性的因素之一。因此本文利用电磁计算研究了35.2 GHz毫米波辐照时细胞SAR的分布情况并探究了对SAR具有影响作用的几个因素。电磁计算实验通过设计不同的培养皿材质、天线放置位置来研究细胞层的SAR。研究表明以上两种因素可以影响细胞SAR的分布，其中固定天线位置，不同材质的培养皿中细胞层分布不同，塑料培养皿中SAR分布较均匀；相同材质的培养皿中，当天线置于培养皿下方时SAR值分布均匀，较少出现冷热点。以上结果表明，细胞实验中，培养皿材质及探头放置位置会影响到细胞实际的SAR分布，从而可能会影响实验的结果。而本研究中探头放置位置的结果与赵建勋等人的研究结果相同[31]，当毫米波从培养皿的上部辐照时，由于细胞层上覆盖的培养液除了吸收部分穿过的毫米波外还会大幅度反射入射的毫米波，因此细胞实验中选择将天线置于培养皿下方是研究毫米波对贴壁肿瘤细胞影响较为理想的辐照方式。通过电磁计算实验了解细胞SAR的分布，可以为后续类似的研究提供参考。
综上所述，35.2 GHz毫米波辐照能够通过caspase-3途径显著抑制A375细胞的活性，电磁计算实验得到的辐照参数对实际细胞实验具有较大的指导意义。
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