2019, Vol. 39
2. 石家庄循环化工园区医院，河北 石家庄 050000
2. Shijiazhuang Circulating Chemical Park Hospital, Shijiazhuang 050000, China
多发性硬化是一种由于自身免疫失衡导致的炎性细胞浸润中枢神经系统形成的慢性复发性中枢神经系统自身免疫性疾病，全球有超过250万患者受累。CD4+T细胞及其细胞因子在多发性硬化的发病机制中发挥了重要作用[1]。原始的CD4+T细胞可以被分为4个亚群，分别为：Th1，Th2，Th17和Treg。Treg在维持免疫平衡和诱导免疫耐受过程中发挥着重要作用[2]。Treg细胞数量减少将会使自身免疫性疾病增加。而且有研究表明在治疗多发性硬化的过程中Treg细胞的数量增加是必不可少的[3]。例如，删除小鼠的Treg将会导致自身免疫性疾病的发生，相反扩增Treg则会缓解自身免疫性脑脊髓炎的病情[4]。以上研究表明多发性硬化和Treg的功能障碍或损害密切相关[3-4]。雷帕霉素是一种安全有效的免疫抑制剂，主要用于器官移植后抑制免疫排斥反应，肿瘤和自身免疫性疾病。雷帕霉素目前在临床上广泛应用被证实安全有效。哺乳动物的雷帕霉素靶点（mTOR）是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点[5-6]。mTOR信号通路抑制Treg细胞的分化，而雷帕霉素可以通过阻断mTOR信号通路促进Treg细胞分化[7]。有研究发现雷帕霉素可以促进Treg细胞的增殖进而诱导免疫耐受[8]。EAE是一种多发性硬化的动物模型，主要用于病理机制研究及有效的筛选治疗多发性硬化有效的药物[9-10]。虽然雷帕霉素的免疫抑制作用已经明确，但雷帕霉素发挥免疫抑制作用的具体机制尚不明确。TGF-β是调控Treg及Th17分化的关键细胞因子，那么雷帕霉素是否能通过影响TGF-β及其下游相关细胞通路调整免疫平衡？本文主要从雷帕霉素对TGF-β/smad信号通路影响方面入手，观察Treg细胞及其相关细胞因子的变化情况。如果雷帕霉素的作用机制得到明确，有助于合理的选用免疫抑制剂及免疫抑制剂的联合应用。
1 材料和方法 1.1 试剂MOG35-55由西安联美生物科技有限公司合成，纯度（HPLC） > 95%：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-ProPhe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys。Lot:C0810300001；百日咳毒素（Pertussis toxin, PTX）Alexis corporation；完全福氏佐剂（CFA）Sigma司；结核菌素H37Ra DIFCO；雷帕霉素（华北制药）；CD4 + CD25+Foxp3+Treg检测试剂盒和Th17检测试剂盒（eBioscience）；IL-17抗体（santacruz）；RPMI 1640培养基和胎牛血清Gibco。smad2，p-smad2，smad3，p-smad3，S6K，p-S6K（Abcom）；TGF-β1及IL-2 R & D；CD4+T细胞磁珠分选（Miltenyi）。
1.2 实验动物实验用C57BL/6雌性近交系小鼠，6~8周，18~20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2006-0009。动物饲养于室温24±2 ℃的环境中，维持光-暗12 h循环交替，并给以足的食料和洁净饮水。
1.3 EAE模型建立将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成5 mg/mL，并按1:1等体积加入CFA，加入结核杆菌H37Ra使其终浓度为4 mg/mL，充分混合乳化。乳化后按每只0.1 mL于小鼠脊柱2侧分4点皮下注射，第0及第48小时腹腔注射0.5 mL PTX（500 ng/只）。于免疫后第10~15天小鼠出现尾部拖地即为免疫成功。本实验室的EAE小鼠免疫成功率在85%~90%。
干预方式：判断小鼠免疫成功后即开始药物干预。用药方式拟采用胃管注入，每只小鼠0.1 mL。干预组分为两个剂量组，雷帕霉素小剂量组（0.3 mg/kg/d）和雷帕霉素大剂量组（1 mg/kg/d）。实验对照组小鼠胃管注入同等体积的PBS溶液。每只小鼠体质量20 g左右，具体用量根据小鼠每天体质量调整。
1.4 临床评分采用Knoz评分法每天给小鼠评分，连续观察30 d，具体评分标准如下：0分无症状；1分尾部失去张力；2分后肢力弱；3分后肢瘫痪；4分后肢及前肢瘫痪；5分濒临死亡或死亡。
1.5 病理及免疫组化法染色免疫后第21天，每组各取5只小鼠，经水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌流，取脊髓石蜡包埋，5 μm连续切片，进行HE染色，LFB染色及IL-17免疫组化染色。
IL-17免疫组化评判标准：日本OLYMPUS公司的光学显微镜观察切片，应用imagepro分析切片并计数。每只小鼠取8个不同的脊髓层面的切片，每张切片放大40倍，连续读取10个视野，取其平均值，进行统计学分析。
1.6 制备脾细胞实验对照组，雷帕霉素小剂量组（0.3 mg/kg）和雷帕霉素大剂量组（1 mg/kg）各取3只小鼠；将小鼠脱颈处死，75%酒精浸泡，小鼠右侧卧位，将左侧腹部皮肤剪开，可见暗红色的脾，分离取出；200目细胞筛上将脾研碎，用2 mL的玻璃注射针芯反复研磨，并用RPMI 1640液冲洗；收集细胞液，800 g/m，离心10 min，弃上清；加入hank's液洗涤细胞2次，800 g/m，10 min，离心弃上清。加入5 mL RPMI 1640培养液，制成脾细胞混悬液。
1.7 酶联免疫吸附（ELISA）的方法检测细胞因子在免疫后21 d，将3组小鼠处死，取脾，制成脾细胞混悬液（方法同上）。之后，将脾细胞在96孔板中培养，每孔2×106细胞，同时在培养板中加入MOG35-55刺激脾细胞72 h。然后收集细胞上清，ELISA分别检测IL-12，IL-23，TGF-β，IL-10，IFN-γ和IL-17细胞因子的变化情况（eBioscience）。所有实验重复4次，结果以均数±标准差表示。
1.8 流式细胞仪检测Treg细胞应用流式细胞仪检测Treg细胞。将脾细胞在24孔板中培养，每孔2×106细胞，在培养板中加入MOG35-55刺激脾细胞24 h。将细胞收集起来，首先在4 ℃，用FICT标记CD4抗体，APC标记CD25。之后将细胞洗涤，再悬浮于固定和通透溶液中。随后在黑暗的4 ℃环境下将细胞用适当稀释的PE标记的抗Foxp3（eBioscience）。之后用流式细胞仪检测Treg细胞。每管最低要求10 000个细胞，通过FACSCalibur流式细胞仪分析上（BD Biosciences）。然后对CD4+T淋巴细胞进行门控和计数。
在小鼠免疫成功后第12天将EAE小鼠处死，制备脾细胞混悬液。之后应用CD4+T细胞磁珠分选仪将CD4+T细胞分选出来，将CD4+T放入96孔板中培养，每孔2 × 106细胞，并加入IL-2和MOG35-55刺激。将CD4+T细胞分为3组，1组加入TGF-β（1 ng/mL），1组加入雷帕霉素（10 nmol/L），最后1组加入TGF-β（1 ng/mL）+雷帕霉素（10 nmol/L）。培养72 h后，应用流式细胞仪分析Treg细胞增殖情况。
1.9 Western blot法分析smad2，p-smad2，smad3，psmad3，S6K，p-S6K表达情况在免疫成功后第21天，处死小鼠，收集脾细胞，立即在液氮中冷冻。之后使用双蛋白-软骨酸蛋白测定试剂盒（Novagen）提取和定量总蛋白。用4%~12%双三硫酸十二烷基钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，Life Technologies）分离含有等量蛋白质的样品，并转入聚偏氟乙烯膜（PVDF，Pierce.，Rockford）。用5%（W/V）脱脂奶粉在TriS缓冲盐水中加入吐温，室温下1 h封闭膜。然后将膜片在4 ℃下与一次性抗smad2抗体（1: 1000；Abcom）、抗p-smad2抗体（1:1000；Abcom）、抗Smad3抗体（1:1000；Abcom）、抗p-smad3抗体（psmad2），抗S6K（1:1000；Abcom）及抗p-S6K（1: 1000；Abcom）。在Tris缓冲盐水加吐温中洗涤三次后，使用相应的二级抗体检测结合抗体。使用Odyssey红外成像系统（Li-CoRBioScience，Lincoln）测量相关蛋白水平。
1.10 统计处理采用SPSS13.0软件进行统计分析，各项指标以均数±标准差表示；临床神经功能评分资料应用MannWhitney U检验；其余计量资料均数的两组间比较应用ANOVA方差分析。P < 0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 雷帕霉素改善EAE小鼠的神经功能评分根据小鼠的发病情况，我们将其分为3期，分别为初期（10~13 d），高峰期（17~21 d）和缓解期（25~28 d）。雷帕霉素大剂量组小鼠与实验对照组小鼠相比，初期两组的神经功能评分即开始出现差异（P < 0.05）。高峰期神经功能评分开始出现明显差异，实验对照组小鼠的神经功能评分明显重于雷帕霉素大剂量组（P < 0.01）。缓解期神经功能评分差别依然明显（P < 0.01）。而雷帕霉素小剂量组小鼠与实验对照组小鼠相比，虽然雷帕霉素小剂量组小鼠发病时间略晚于实验对照组小鼠，但是在初期、高峰期和缓解期的神经功能评分无明显差别。雷帕霉素大剂量组与雷帕霉素小剂量组相比，初期神经功能评分无明显差异。高峰期和缓解期，雷帕霉素大剂量组的神经功能评分较雷帕霉素小剂量组明显减轻（表 1）。
|
表 1 雷帕霉素改善EAE小鼠的临床评分 Tab.1 Rapamycin treatment prevents clinical EAE |
实验对照组的HE染色可见大量炎症细胞浸润，主要位于脊髓的侧索及后索；LFB染色可见实验对照组的脊髓侧索及后索片状髓鞘脱失。雷帕霉素小剂量组同样可以看到炎细胞浸润及髓鞘脱失。而雷帕霉素大剂量组HE染色可见炎细胞浸润明显减少，仅在侧索可见局灶炎细胞浸润；LFB染色可见雷帕霉素大剂量组脊髓的髓鞘脱失明显较试验对照组及雷帕霉素小剂量组轻（图 1）。
|
图 1 雷帕霉素抑制炎症细胞浸润及减少髓鞘脱失 Fig.1 Rapamycin treatment reduces inflammatory cell infiltration and tissue damage in mice with EAE (Original magnification: ×200) |
实验对照组可见大量IL-17的表达，主要位于脊髓侧索和后索，可见大量棕色的细胞，间质也可见到表达，小血管周围可见到套袖样表现，灰质也可见到少量IL- 17的表达。与实验对照组相比，雷帕霉素小剂量组的IL-17表达略有减少，在脊髓的侧后索可以见到细胞及其间质有IL-17表达，无明显统计学意义。而雷帕霉素大剂量组的IL-17表达则较实验对照组及雷帕霉素小剂量组明显减少（图 2）。
|
图 2 雷帕霉素抑制Th17细胞在EAE中枢神经系统浸润 Fig.2 Rapamycin inhibits Th17 infiltration in the spinal cord of mice with EAE. The data are expressed as Mean±SD (×200). *P < 0.01 vs control group |
CD4+T细胞可分为两大亚群，分别是炎性细胞亚群Th17、Th1和抗炎性细胞亚群Treg、Th2，这两对细胞亚群间的平衡可以调控免疫反应的方向。如果炎性细胞因子增加将会导致多发性硬化等自身免疫性疾病，相反如果抗炎性细胞因子增加则可减轻自身免疫性疾病的病情。在本研究中，我们应用不同剂量的雷帕霉素干预EAE小鼠，观察炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的变化情况。收集不同组别的脾细胞上清，并用ELISA的方法进行检测。结果发现，雷帕霉素大剂量组与实验对照组相比，可以抑制IL-12，IFN-γ，IL-17和IL-23炎性细胞因子同时诱导IL-10和TGF-β抗炎性细胞因子。而雷帕霉素小剂量组与实验对照组相比无明显差别（图 3）。
|
图 3 雷帕霉素抑制炎性细胞因子同时诱导抗炎性细胞因子 Fig.3 Rapamycin inhibits inflammatory cytokines and induces anti-inflammatory cytokines. Rapamycin promotes induction of Th2 and Treg myelin reactive T cells and inhibits induction of Th1 and Th17. Splenocytes were obtained on day 21 post immunization and cultured in the presence of MOGp35-55 at the doses indicated. Supernatants were examined for Th1 (IFN-γ and IL-12), Th17 (IL-17 and IL-23), Th2 (IL-10) and Treg (TGF-β) cytokines by ELISA. Data are presented as Mean±SD |
在本研究中我们应用雷帕霉素干预EAE小鼠，观察是否可以同样抑制Treg细胞的分化。将脾细胞上流式细胞仪检测，利用FSC/SSC将淋巴细胞分出，以淋巴细胞设门，分选出Treg细胞，并分析Treg细胞在CD4+T所占的百分比。结果发现，雷帕霉素大剂量组与实验对照组相比，Treg细胞在CD4+T细胞中的百分比明显增高。而雷帕霉素小剂量组与实验对照组相比无明显差别（图 4）。
|
图 4 雷帕霉素促进外周Treg细胞的分化 Fig.4 Rapamycin protects against EAE via promoting differentiation of peripheral Treg cells. The data are expressed as Mean±SD. *P < 0.01 vs control group |
S6K是mTOR的下游产物，磷酸化的S6K是其活性产物。实验结果显示无论大剂量雷帕霉素还是小剂量雷帕霉素均能有效的抑制p-S6K的表达，而S6K不受影响。TGF-β和TGF-β受体结合后可以激活smad2和smad3，磷酸化的smad2和smad3是其活性产物。Smad2和smad3与Treg细胞的增殖密切相关。实验结果显示随着雷帕霉素的剂量增加，p-smad2和p-smad3表达也增加，而smad2和smad3的表达无明显变化。实验结果表明雷帕霉素可能通过上调TGF-β/Smad信号通路来促进Treg的增殖（图 5）。
|
图 5 雷帕霉素通过抑制mTOR来激活p-smad2和p-smad3 Fig.5 Rapamycin activates p-Smad2 and p-smad3 by inhibiting mTOR |
雷帕霉素可以选择性的扩增nTreg细胞。而雷帕霉素扩增Treg的机制可能与TGF-β密切相关。为了进一步观察TGF-β在雷帕霉素扩增Treg细胞中的作用，我们分离并培养小鼠CD4+T细胞，分别加入雷帕霉素（10 nmol/L）和雷帕霉素（10 nmol/L）+TGF-β（1 ng/mL）。结果发现雷帕霉素+TGF-β组的Treg在CD4+T细胞中的比例明显高于单用雷帕霉素组。试验结果表明雷帕霉素在扩增Treg细胞过程中需要TGF-β的参与（图 6）。
|
图 6 雷帕霉素联合TGF-β促进Treg细胞增殖 Fig.6 Rapamycin combined with TGF-β promotes proliferation of Treg cells. The data are expressed as Mean±SD. *P < 0.01 vs control group |
雷帕霉素是一种新型的免疫抑制剂，主要用于器官抑制后抗抑制排斥反应。雷帕霉素通过抑制mTOR活性来发挥其免疫抑制作用，有研究证实其可以用于自身免疫性疾病的治疗[7]。我们应用雷帕霉素干预EAE小鼠，通过临床和病理两方面的评价来研究雷帕霉素治疗MS的免疫抑制作用。本研究发现雷帕霉素大剂量组可以明显抑制EAE的病情进展，在发病率以及各期（发病初期，高峰期和缓解期）的临床评分均优于实验对照组。这些研究发现提示我们应进一步研究雷帕霉素治疗多发性硬化的免疫机制。
雷帕霉素通过与其细胞受体FKBP12（FK506结合蛋白12kDa）形成复合物发挥其功能，该复合物阻断mTOR（一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶），进而调节蛋白之间的相互作用[11]。而mTOR信号通路与一系列的病理和生理的细胞进程相关。在一定条件下，mTOR信号通路被激活，同时其下游的信号分子也被激活。有研究证实，激活mTOR信号通路可以抑制Treg细胞的增殖，而通过抑制mTOR信号通路则可以促进Treg细胞的增殖[12]。许多在动物或人类身上进行的体内或体外实验已经证明雷帕霉素可以扩增具有免疫抑制性的Treg细胞亚群[13]。并且在EAE动物的缓解期发现在中枢神经系统有大量的CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞聚集[3]。这说明Treg细胞与减低疾病的活动性相关。另外也说明雷帕霉素可以扩增Treg细胞，这可能是其发挥药效的机制。Treg对EAE具有保护作用，雷帕霉素可以诱导活性的Treg[14]，这说明EAE小鼠脾中的CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞数量增加与雷帕霉素治疗EAE有明确的联系。
TGF-β和IL-2已被证实是原始T淋巴细胞向Treg细胞分化的关键细胞因子[15]，然而TGF-β和IL-2共同作用诱导产生的Treg细胞不稳定，免疫抑制作用弱。多项研究显示全反式维甲酸与TGF-β和IL-2一起可以增强原始T细胞向Treg细胞的分化[16-18]。而在TGF-β和IL-2存在的条件下，雷帕霉素诱导Treg细胞产生的能力远高于全反式维甲酸[19]。
目前已经明确IL-2/IL-2R信号通路可以调控Treg的发育和外周Treg的活性，在纯化的CD4+CD25+T细胞中IL-2可以上调Foxp3，具体机制为STAT3/5蛋白与位于Foxp3基因序列中的第一内含子中的高度保守的STAT结合位点相结合[20]。但是IL-2与IL-2R结合后除了激活STAT5外，同时募集PI3K。PI3K信号通路可通过mTOR抑制ROS，而ROS可以上调TGF-β/smad信号通路活性[21]。
TGF-β也是促进Treg细胞分化的关键细胞因子，TGF-β/smad信号通路可以促进Foxp3的表达。其中smad是TGF-β信号传导通路的胞内传导子，在TGF-β诱导foxp3的过程中，smad3调控着大部分的TGF-β的作用。Tone和他的同事研究发现smad3和NFAT可以共同作用并促进foxp3增强子区域的组蛋白乙酰化以进一步诱导foxp3转录[22]。Smad3基因敲出小鼠与野生型小鼠相比，TGF-β诱导foxp3产生的数量明显减少[23]。Smad3与增强子1结合可以正向或负向调节foxp3基因[24]。smad2和smad3一样发挥着重要作用[25]。在体外，应用TGF-β处理从smad2 CKO或smad3 KO小鼠中获得的CD4+CD25+ T细胞，结果也野生型小鼠相比foxp3的数量减少了20%~30%。在foxp3+iTreg体外诱导过程中，smad2和smad3都只发挥着部分作用（20%~ 30%）。Smad2和smad3功能上有重复的部分，可以在T细胞上发挥相同的功能，当一个缺失时另外一个可以互补其作用。有人用基因芯片的方法研究smad2 CKO，smad3 KO以及双KO杂交的CD4+T细胞与smad2++ smad3++CD4+T细胞比较基因表达的异同[26]。结果发现smad2特异性基因为8%，smad3特异性基因为20%，而对smad2和smad3都依赖的基因为64%，其中就包括foxp3。这说明在TGF-β介导的T细胞转录调节过程中不仅需要smad3也同样需要smad2。
根据以上我们知道，TGF-β和IL-2均在Treg细胞分化过程中发挥着重要作用。而IL-2/IL-2R信号通路在一定程度上可以通过PI3K-mTOR通路抑制TGF-β/ smad信号通路，进而减弱Treg细胞的分化。而雷帕霉素则可以解除这种抑制，促进p-smad2和p-smad3的表达，从而促进Treg细胞的增殖[14]。这与我们的实验结果相一致，雷帕霉素大剂量组的CD4+CD25+FoxP3+T细胞所占CD4+的比例明显高于实验对照组，p-smad2和p-smad3表达增加。
TGF-β和雷帕霉素都能抑制T细胞的增殖，这与他们都能促进Treg细胞相关[27-29]。我们的实验结果显示TGF-β和雷帕霉素分别都能促进Treg细胞的增殖，而TGF-β和雷帕霉素联合作用则可以明显促进Treg细胞的增殖，这说明雷帕霉素很大程度上依赖TGF-β发挥免疫抑制作用。
多发性硬化（MS）是一种慢性复发性疾病，以免疫调节异常和炎症细胞浸润到中枢神经系统（CNS）为特征。MS的发病机制尚不完全清楚，缺乏有效的治疗手段。目前已有雷帕霉素治疗复发缓解型或继发进展型MS患者的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验正在进行中。另外，在一个临床开放实验中证明临床确诊的复发缓解型或继发进展型MS接受雷帕霉素治疗后均明显受益，主要表现为新发的核磁增强病灶和发作次数减少[30-31]。但雷帕霉素治疗MS的具体机制尚不明确。本文探索了雷帕霉素发挥免疫抑制作用的具体机制，这样将有助于选择雷帕霉素与作用不同靶点的免疫抑制剂联合应用[32]。
目前免疫抑制剂广泛应用于自身免疫疾病的治疗。雷帕霉素作为一种新型免疫抑制剂，具有免疫抑制强、副作用小等优点。总的来说，雷帕霉素可以通过影响TGF-β/smad信号通路，促进Treg细胞的增殖，减少中枢神经系统炎性细胞的浸润，改善EAE小鼠的病情。因此雷帕霉素可以通过阻断炎症反应和调节免疫来改善EAE的病情。我们的实验结果说明雷帕霉素是一种安全有效，易于服用的治疗多发性硬化等自身免疫性疾病的药物。
| [1] |
Schloeder J, Berges C, Luessi F, et al. Dimethyl fumarate therapy significantly improves the responsiveness of T cells in multiple sclerosis patients for immunoregulation by regulatory T cells[J].
Int J Mol Sci, 2017, 18(2): 271.
DOI: 10.3390/ijms18020271. |
| [2] |
Sakaguchi S. Naturally arising CD4 + regulatory t cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses[J].
Annu Rev Immunol, 2004, 22: 531-62.
DOI: 10.1146/annurev.immunol.21.120601.141122. |
| [3] |
Mcpherson RC, Turner DG, Iris M, et al. T-bet expression by Foxp3+ T regulatory cells is not essential for their suppressive function in CNS autoimmune disease or colitis[J].
Frontiers Immunol, 2015, 6: 69.
|
| [4] |
Zozulya AL, Wiendl H. The role of regulatory T cells in multiple sclerosis[J].
Nat Clin Pract Neurol, 2008, 4(7): 384-98.
DOI: 10.1038/ncpneuro0832. |
| [5] |
Zhao YG, Wang Y, Guo Z, et al. Dihydroartemisinin ameliorates inflammatory disease by its reciprocal effects on Th and regulatory T cell function via modulating the mammalian target of rapamycin pathway[J].
J Immunol, 2012, 189(9): 4417-25.
DOI: 10.4049/jimmunol.1200919. |
| [6] |
Koga T, Hedrich CM, Mizui MA, et al. CaMK4-dependent activation of AKT/mTOR and CREM-alpha underlies autoimmunity-associated Th17 imbalance[J].
J Clini Invest, 2014, 124(5): 2234-45.
DOI: 10.1172/JCI73411. |
| [7] |
Chapman NM, Chi HB. mTOR signaling, tregs and immune modulation[J].
Immunotherapy, 2014, 6(12): 1295-311.
DOI: 10.2217/imt.14.84. |
| [8] |
Kim KW, Chung BH, Kim BM, et al. The effect of mammalian target of rapamycin inhibition on T helper type 17 and regulatory T cell differentiation in vitro and in vivo in kidney transplant recipients[J].
Immunology, 2015, 144(1): 68-78.
|
| [9] |
Dello Russo C, Lisi L, Feinstein DL. mTOR kinase, a key player in the regulation of glial functions: relevance for the therapy of multiple sclerosis[J].
Glia, 2013, 61(3): 301-11.
DOI: 10.1002/glia.v61.3. |
| [10] |
Lisi L, Navarra P, Cirocchi R, et al. Rapamycin reduces clinical signs and neuropathic pain in a chronic model of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].
J Neuroimmunol, 2012, 243(1/ 2): 43-51.
|
| [11] |
Yang HJ, Rudge DG, Koos JD, et al. mTOR kinase structure, mechanism and regulation[J].
Nature, 2013, 497(7448): 217.
DOI: 10.1038/nature12122. |
| [12] |
Schmidt A, Eriksson M, Shang MM, et al. Comparative analysis of protocols to induce human CD4+Foxp3+ regulatory T cells by combinations of IL-2, TGF-beta, retinoic acid, rapamycin and butyrate[J].
PLoS One, 2016, 11(2): e0148474.
DOI: 10.1371/journal.pone.0148474. |
| [13] |
Biswas M, Sarkar D, Kumar SR, et al. Synergy between rapamycin and FLT3 ligand enhances plasmacytoid dendritic cell-dependent induction of CD4+CD25+FoxP3+ Treg[J].
Blood, 2015, 125(19): 2937-47.
DOI: 10.1182/blood-2014-09-599266. |
| [14] |
Sun IH, Oh MH, Zhao L, et al. mTOR complex 1 signaling regulates the Generation and function of central and effector Foxp3(+) regulatory T cells[J].
J Immunol, 2018, 201(2): 481-92.
|
| [15] |
Zheng SG, Gray JD, Ohtsuka K, et al. Generation ex vivo of TGFbeta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors[J].
J Immunol, 2002, 169(8): 4183-9.
DOI: 10.4049/jimmunol.169.8.4183. |
| [16] |
Benson MJ, Pino-Lagos K, Rosemblatt MA. All-trans retinoic acid mediates enhanced T reg cell growth, differentiation, and gut homing in the face of high levels of co-stimulation[J].
J Exp Med, 2007, 204(8): 1765-74.
DOI: 10.1084/jem.20070719. |
| [17] |
Mucida D, Park Y, Kim G, et al. Reciprocal TH17 and regulatory T cell differentiation mediated by retinoic acid[J].
Science, 2007, 317(5835): 256-60.
DOI: 10.1126/science.1145697. |
| [18] |
Nolting J, Daniel C, Reuter S, et al. Retinoic acid can enhance conversion of naive into regulatory T cells independently of secreted cytokines[J].
J Exp Med, 2009, 206(10): 2131-9.
DOI: 10.1084/jem.20090639. |
| [19] |
Candia E, Reyes P, Covian C, et al. Single and combined effect of retinoic acid and rapamycin modulate the Generation, activity and homing potential of induced human regulatory T cells[J].
PLoS One, 2017, 12(7): e0182009.
DOI: 10.1371/journal.pone.0182009. |
| [20] |
Zorn E, Nelson EA, Mohseni M, et al. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4 + CD25 + regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo[J].
Blood, 2006, 108(5): 1571-9.
DOI: 10.1182/blood-2006-02-004747. |
| [21] |
Wu Y, Wang W, Peng XM, et al. Rapamycin upregulates connective tissue growth factor expression in hepatic progenitor cells through TGF-beta-Smad2 dependent signaling[J].
Front Pharmacol, 2018, 9: 877.
DOI: 10.3389/fphar.2018.00877. |
| [22] |
Tone Y, Furuuchi K, Kojima Y, et al. Smad3 and NFAT cooperate to induce Foxp3 expression through its enhancer[J].
Nat Immunol, 2008, 9(2): 194-202.
DOI: 10.1038/ni1549. |
| [23] |
Wang YY, Jiang H, Wang YC, et al. Deletion of Smad3 improves cardiac allograft rejection in mice[J].
Oncotarget, 2015, 6(19): 17016-30.
|
| [24] |
Xu LL, Kitani A, Stuelten C, et al. Positive and negative transcriptional regulation of the Foxp3 gene is mediated by access and binding of the Smad3 protein to enhancer I[J].
Immunity, 2010, 33(3): 313-25.
DOI: 10.1016/j.immuni.2010.09.001. |
| [25] |
Zheug SG, Lu L, Wang JL, et al. Role of Smad and non-Smad signals in the development of Th17 and regulatory T cells[J].
J Immunol, 2010, 184(1): 4295-306.
|
| [26] |
Tomohito T, Yu W, Takashi S, et al. Smad2 and Smad3 are redundantly essential for the TGF-b-mediated regulation of regulatory T plasticity and Th1 development[J].
J Immunol, 2010, 185: 842-55.
DOI: 10.4049/jimmunol.0904100. |
| [27] |
Zhang W, Dong Z, Shen M, et al. Combined administration of a novel mutant TGF-β1/Fc and rapamycin promotes induction of regulatory T cells and islet allograft tolerance[J].
J Immunol, 2010, 185(8): 4750-9.
DOI: 10.4049/jimmunol.1000769. |
| [28] |
Kawamoto K, Pahuja A, Hering BJ. Transforming growth factor beta 1 (TGF-beta 1) and rapamycin synergize to effectively suppress human T cell responses via upregulation of FoxP3(+) Tregs[J].
Transpl Immunol, 2010, 23(1/2): 28-33.
|
| [29] |
Kappos L, Barkhof F, Desmet A, et al. The effect of oral temsirolimus on new magneticresonance imaging scan lesions, brain atrophy, and the number of relapses inmultiplesclerosis: results from a randomized, controlled, clinical trial[J].
J Neurol, 2005, 252: S46.
DOI: 10.1007/s00415-005-5008-1. |
| [30] |
Neuhaus O, Kieseier BC, Hartung HP, et al. Immunosupperssive agents in multiple sclerosis[J].
Am Soc Exp Neurotherap, 2007, 4: 654-60.
DOI: 10.1016/j.nurt.2007.08.003. |
| [31] |
Hou H, Cao R, Quan M, et al. Rapamycin and fingolimod modulate Treg/Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis by regulating the Akt-mTOR and MAPK/ERK pathways[J].
J Neuroimmunol, 2018, 324: 26-34.
DOI: 10.1016/j.jneuroim.2018.08.012. |