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  南方医科大学学报  2018, Vol. 38Issue (12): 1527-1532, 封三页  DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2018.12.21.
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刘丽诗, 韩凯, 王琦, 高琰, 王晶莹, 曾抗. 0.5%鬼臼毒素纳米脂质载体在阴道黏膜的毒性试验[J]. 南方医科大学学报, 2018, 38(12): 1527-1532, 封三页. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2018.12.21.
LIU Lishi, HAN Kai, WANG Qi, GAO Yan, WANG Jingying, ZENG Kang. Acute and chronic toxicity of 0.5% podophyllotoxin-loaded nanostructured lipid carriers to vaginal mucosa in rabbits and rats[J]. Journal of Southern Medical University, 2018, 38(12): 1527-1532, 封三页. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2018.12.21.

基金项目

广东省自然科学基金（2014A030313319）

作者简介

刘丽诗，在读硕士研究生，E-mail: 521074314@qq.com。

通信作者

通信作者：
曾抗，教授，博士导师，主任医师，E-mail: npfkzk@126.com

文章历史

收稿日期：2018-06-08
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
0.5%鬼臼毒素纳米脂质载体在阴道黏膜的毒性试验
刘丽诗 , 韩凯 , 王琦 , 高琰 , 王晶莹 , 曾抗     
南方医科大学南方医院皮肤科，广东 广州 510515
收稿日期：2018-06-08
基金项目：广东省自然科学基金（2014A030313319）
作者简介：刘丽诗，在读硕士研究生，E-mail: 521074314@qq.com。
通信作者：曾抗，教授，博士导师，主任医师，E-mail: npfkzk@126.com。
摘要: 目的 考察0.5%鬼臼毒素纳米脂质载体在阴道黏膜的安全性。方法 (1) 刺激性试验:将12只新西兰兔均分为3组, 分别予生理盐水(NS)、0.5%鬼臼毒素酊剂(POD-T)和0.5%鬼臼毒素纳米脂质载体(POD-NLC), 阴道给药10 d后取阴道组织行病理检查, 根据Eckstein评分标准进行评估。(2)急性毒性试验:将20只SD雌性大鼠均分2组, 分别予赋形剂和POD-NLC, 以300倍临床剂量在24 h内分3次阴道给药, 连续观察14 d后解剖并计算脏器系数。(3)长期毒性试验:80只SD雌性大鼠均分4组, 分别予赋形剂、低剂量POD-NLC (15倍临床剂量)、中剂量POD-NLC (30倍临床剂量)和高剂量POD-NLC (60倍临床剂量)。连续13周每日阴道给药1次, 每周记录体质量, 给药结束后对每组2/3的大鼠进行抽血化验、解剖并计算脏器系数和肝脏组织病理学检查。为观察药物延迟毒性, 每组剩余1/3的大鼠停药观察2周后做同前处理。结果 (1) 刺激性试验:0.5% POD-NLC对阴道黏膜为极轻刺激性, 0.5% POD-T为中度刺激性; (2)急性毒性试验:赋形剂组与POD-NLC组大鼠相比, 各器官的脏器系数的差异无统计学意义(P>0.05);(3)长期毒性试验:赋形剂组与POD-NLC各剂量组大鼠的一般表现、行为活动、体质量变化、血常规、血生化、重要器官脏器系数及肝脏病理未见明显异常, 且组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 POD-NLC在阴道黏膜用药刺激性较小, 对机体无明显的急性及长期毒性, 有较高的安全性。
关键词: 鬼臼毒素    纳米脂质载体    刺激性    急性毒性    长期毒性    尖锐湿疣    
Acute and chronic toxicity of 0.5% podophyllotoxin-loaded nanostructured lipid carriers to vaginal mucosa in rabbits and rats
LIU Lishi , HAN Kai , WANG Qi , GAO Yan , WANG Jingying , ZENG Kang     
Department of Dermatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Abstract: Objective To test the acute and chronic toxicity of topical application of 0.5% podophyllotoxin-loaded nanostructured lipid carriers (POD-NLC) to the vaginal mucosa. Methods Twelve New Zealand rabbits were randomized into 3 groups and subjected to daily topical applications of normal saline (control group), 0.5% podophyllotoxin tincture (POD-T) or 0.5% POD-NLC on the vaginal mucosa for 10 consecutive days, and the pathological changes in the mucosa were graded using the Eckstein scoring system.The acute toxicity of POD-NLC was tested in 20 SD female rats, which received intravaginal administration of POD-NLC or vehicle for 3 times within 24 h; After 14 days of continuous observation, the rats were dissected for calculating the viscera coefficient.For testing the chronic toxicity of POD-NLC, 80 SD female rats were randomized into 4 groups and subjected to daily intravaginal administration of the vehicle or POD-NLC at low, moderate or high doses for 13 consecutive weeks.The rats were weighed once a week and at the end of the experiment, 2/3 of the rats from each group were sacrificed to collect blood samples, calculate the viscera coefficient, and examine the pathological changes in the liver.The remaining 1/3 rats were observed for another 2 weeks without further drug treatment and the same examinations were performed. Results In the rabbits, 0.5% POD-NLC elicited only mild irritation while POD-T caused moderate irritation of the vaginal mucosa.In the acute toxicity test, the organ coefficients were comparable between the rats treated with the vehicle and POD-NLC (P>0.05).Long-term intravaginal administration of POD-NLC did not produce significant changes in the behavior, activity, body weight, blood biochemical profiles or organ coefficient as compared with the vehicle control group (P>0.05). Conclusions Intravaginal administration of 0.5% POD-NLC causes very mild irritation without obvious acute or chronic toxicity to the vaginal mucosa in rabbits and rats.
Keywords: podophyllotoxin    nanostructured lipid carrier    irritation    acute toxicity    chronic toxicity    condyloma acuminate    

尖锐湿疣是最常见的性传播疾病（STD）之一[1]，90%以上的尖锐湿疣由HPV-6和HPV-11感染引起[2]，典型皮损为性接触部位表面乳头瘤状的赘生物[3]。鬼臼毒素（POD）作为世界卫生组织推荐用于治疗尖锐湿疣的外用药物，主要通过抑制感染HPV的宿主细胞增殖分化来减少HPV的复制，同时诱导感染细胞凋亡来达到治疗效果[4-6]。目前临床广泛应用的POD制剂为鬼臼毒素酊剂（POD-T），仅适用于皮肤部位的尖锐湿疣。阴道等黏膜上皮与皮肤相比没有角质层，所以POD-T的酊剂载体易对黏膜产生明显刺激，常导致黏膜糜烂，甚至溃疡形成。目前阴道黏膜尖锐湿疣的治疗主要以冷冻、微波和光动力等物理疗法为主，患者不仅术后出现明显的疼痛，且创面暴露有继发感染风险，治疗费用相对高昂。因此寻求适用于黏膜部位尖锐湿疣的治疗POD新型载体迫在眉睫。纳米脂质载体（NLC）是近年新兴的药物载体，由类细胞生物膜的微囊体组成[7]。不仅生物相容性好，免疫原性低，且体积较小，药物有效接触面更大，可提高药效[8]。综上所述，为了使POD适用于黏膜部位尖锐湿疣，本团队创新性地把药物POD与载体NLC相结合，形成POD-NLC。本团队前期通过正交实验优化POD-NLC的合成处方得到稳定的PODNLC [9]。其次，通过Annexin V/PI检测发现POD-NLC诱导凋亡的效果明显优于POD-T [10]。通过动物实验证明POD-NLC的缓释性、黏膜靶向性优于POD-T [11-12]。最后，本研究将通过毒理学实验考察POD-NLC在阴道黏膜应用的安全性。

尽管国内外亦有把POD与其他新型载体相结合的研究，如羧基化碳纳米管负载鬼臼毒素、鬼臼毒素—固体脂质纳米粒等[13-14]，这些研究虽证明新载体药物在动物皮肤上的应用毒性有所下降，但均未进行动物体内黏膜用药的毒理学实验，且实验时间短，未进行长期毒性试验，对于临床用药的指导性有限。本研究不仅创新性地研究了POD-NLC在动物阴道黏膜用药的安全性，填补目前POD治疗阴道黏膜尖锐湿疣的空白，还将重点评估该剂型POD的长期毒性，为临床POD-NLC黏膜应用提供安全用药资料。

1 材料和方法 1.1 实验动物

新西兰兔12只，雌性，健康无孕，体质量2.0~2.5 kg，年龄约4~6月，普通级；SD大鼠100只，雌性，健康无孕，体质量180~220 g，约6~8周龄，SPF级。动物均由南方医科大学南方医院动物实验中心提供。实验前动物驯养观察1周，进行外观体征、行为活动、摄食量、体质量、粪便性状评估。

1.2 实验药物

0.5% POD-NLC及赋形剂（空白-NLC）的制备及理化性质参考本课题组前期工作[9]；将0.5 g POD溶于100 mL的75%乙醇制得0.5% POD-T。

1.3 实验方法 1.3.1 刺激性试验

将12只新西兰兔平均分为3组：生理盐水对照组（NS）、0.5%鬼臼毒素酊剂组（POD-T）和0.5%鬼臼毒素纳米脂质载体组（POD-NLC）。给药前用速眠新Ⅱ肌肉注射以麻醉新西兰兔，用石蜡油涂抹阴道口以保护和润滑。连续10 d往新西兰兔阴道注入2 mL NS或POD-T或POD-NLC。给药结束后处死实验动物，解剖取出阴道，选取阴道上、中、下3个部位的组织，制备HE染色的组织病理切片，采用Eckstein评分系统对镜下改变进行评估[15-19]。

根据阴道黏膜的上皮组织、固有层白细胞浸润、固有层血管充血、固有层水肿四项进行Eckstein评分，每一项得分为0~4分，具体评分标准如下，上皮组织：0=完好无损、1=细胞变性或变扁平、2=组织变形、3=局部糜烂、4=广泛糜烂；固有层白细胞浸润（每个高倍镜视野）：0=无、1=极少（< 25个）、2=轻度（26~50个）、3=中度（51~ 100个）、4=重度（>100个）；固有层血管充血（毛细血管增殖）：0=无、1=极少、2=轻度、3=中度、4=重度伴血管破裂；固有层水肿：0=无、1=极少、2=轻度、3=中度、4=重度。四项评分相加即为刺激性反应的总积分。刺激性指数为每组积分减去NS对照组积分，刺激性指数与刺激性反应强度分级的具体对应如下：< 1=无，1~ < 5=极轻，5~ < 9=轻度，9~ < 12=中度，≥12=重度。

1.3.2 急性毒性试验

20只SD雌性大鼠平均分为2组：赋形剂组和POD-NLC组，将300倍临床剂量的赋形剂或POD-NLC，在24 h内分3次通过阴道给药，给药后观察动物的一般情况及行为活动，一般情况评估包括：大鼠是否出现困倦、呼吸困难、尾口足紫绀或苍白、眼鼻口异常分泌物、皮毛色泽及分布改变、大小便性状等情况。行为活动评估包括：大鼠是否出现俯卧、僵住、震颤、抽搐及痉挛等异常活动，探究活动、自发活动或者打理毛发等运动减少或增多，正常反射消失和异常反射出现等。连续观察14 d后麻醉解剖大鼠，观察各组大鼠的肾上腺、肾脏、脾脏、肝脏、卵巢、子宫、胸腺、肺脏、心脏、脑等主要器官的肉眼变化，然后分别称质量，并按公式计算脏器系数：器官的脏器系数=器官质量（g）/体质量（100 g）[20-22]。

1.3.3 长期毒性试验

80只SD雌性大鼠平均分为4组：对照组（赋形剂）、POD-NLC低剂量组（15倍临床剂量）、POD-NLC中剂量组（30倍临床剂量）和POD-NLC高剂量组（60倍临床剂量）。连续13周每天阴道上药1次，记录每周体质量，观察给药期间大鼠的一般情况及行为活动，给药结束后对每组2/3的大鼠进行抽血检查、解剖并计算脏器系数。对照组与高剂量组进行肝脏病理形态学检查，若发现病理改变，其他剂量组大鼠亦需进行病理学检查。为观察药物的延迟毒性，每组剩余的1/3大鼠停药观察2周后做同前处理[23-27]。

1.3.4 统计学分析

资料均采用均数±标准差表示，采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。两组间比较使用t检验，多组间比较使用方差分析，当P < 0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 刺激性试验结果 2.1.1 新西兰兔上药后阴道黏膜肉眼变化及高倍镜下的HE染色结果

对比给药10 d后各组阴道组织的肉眼变化：NS组和POD-NLC组阴道黏膜光滑完整；POD-T组可见点状糜烂、溃疡面，伴白色疤痕样的纤维结缔组织增生。对比各组阴道组织HE染色后在高倍镜下的特征：NS组的黏膜结构清晰完整；POD-T组的黏膜呈大片坏死，难以观察到正常上皮结构，部分切片可见固有层水肿明显、大量淋巴细胞或者中性粒细胞浸润、血管破裂；POD-NLC组黏膜结构清晰，部分黏膜表皮较NS组变薄。

图 1 新西兰兔给药后阴道黏膜肉眼变化及高倍镜下的HE染色结果 Fig.1 Gross observation of the vaginal mucosa of the New Zealand rabbits in normal saline (A), POD-T (B), and POD-NLC (C) groups and pathological examination of the mucosa in normal saline (D, E), POD-T (F, G), and POD-NLC (H, I) groups (HE staining, original magnification: ×400).
2.1.2 阴道黏膜刺激性反应评分结果

根据表 1各组阴道黏膜刺激性反应评分，NS组总平均分为1.333分；POD-T组总平均分为12.250分；POD-NLC组总平均分为3.750分。按照上述刺激性强度分级标准，POD-T组总平均分减去NS组总平均分为10.917 < 12分，是中度刺激性；POD-NLC组总平均分减去NS组总平均分为2.417分 < 5分，是极轻刺激性。

表 1 各组阴道黏膜刺激性反应评分 Tab.1 Mean scores of vaginal mucosa irritation of the rabbits based on the Eckstein scoring system (Mean±SD)
2.1.3 刺激性试验不良反应

POD-T组在给药第2天，1只动物出现血尿，症状持续至本实验结束；且POD-T组在给药第4天，另1只动物出现死亡；NS组及POD-NLC组无类似现象。

2.2 急性毒性试验 2.2.1 大鼠一般情况及行为活动

赋形剂组和PODNLC组的实验大鼠在观察期间内，一般情况及行为活动均未见明显异常，无动物出现死亡等不良反应。

2.2.2 大鼠器官解剖及脏器系数

解剖两组实验大鼠，肉眼观察发现两组大鼠的肾上腺、肾脏、脾脏、肝脏、卵巢、子宫、胸腺、肺脏、心脏、脑等器官的外观、体积、颜色等无明显差异，器官亦无出血、充血或者水肿等异常变化。称质量并计算各器官的脏器系数，发现两组大鼠各器官的脏器系数差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 长期毒性试验 2.3.1 大鼠一般情况及行为表现

赋形剂组、POD-NLC低剂量组、POD-NLC中剂量组及POD-NLC高剂量组的实验大鼠各项观察指标均未见明显异常。大鼠食欲良好、饮水正常；毛发浓密而洁净、光滑有色泽；口、足垫、尾巴皮肤呈健康粉色，未见紫绀症状；阴道、肛门、眼、耳、口、鼻未见分泌物增多或异样的血性分泌物；呼吸平稳顺畅，未见呼吸急促、呼吸困难、喘息、咳嗽等现象；翻正反射、惊跳反射正常；四肢活动、步态正常、运动协调，未见异常运动，无俯卧、震颤、抽搐、强直、僵住等现象；粪便颗粒成形，呈棕褐色，未见稀粪现象和血尿。

2.3.2 大鼠体质量变化

图 2为第1~13周各组实验大鼠每周的体质量折线图，提示在观察期间，各组大鼠的体质量均呈稳步增长趋势，且增长速率相近。通过统计学分析，各组实验大鼠每周体质量的差异无统计学意义（P>0.05）。

图 2 长期毒性试验各分组全部大鼠在第1~13周体质量 Fig.2 Comparison of body weight of the rats in longterm toxicity test at weeks 1-13 (Mean±SD).
2.3.3 大鼠血常规及血生化结果

表 2、表 3分别为各组大鼠血常规、血生化的结果，通过统计学分析，各组2/3大鼠在13周上药结束后，血常规、血生化的差异均无统计学意义（P>0.05）。为观察药物的延迟毒性，各组剩余1/3大鼠在上药13周后，停药2周，即在第15周做相同处理，结果提示各组剩余1/3大鼠在第15周的血常规、血生化的差异亦无统计学意义（P>0.05）。随后，我们把各组第13周与第15周的血常规、血生化进行对比，发现各组前后血常规、血生化的差异仍然无统计学意义（P> >0.05）。

表 2 长期毒性试验第13周与第15周各组大鼠的血常规结果 Tab.2 Blood routine of the rats in the long-term toxicity test at 13 and 15 weeks (Mean±SD)
表 3 长期毒性试验第13周与第15周各组大鼠的血生化结果 Tab.3 Blood biochemistry of the rats in the long-term toxicity test at 13 and 15 weeks (Mean±SD)
2.3.4 大鼠器官解剖及脏器系数

通过解剖发现，赋形剂组、POD-NLC低剂量组、POD-NLC中剂量组及POD-NLC高剂量组在第13周2/3大鼠和第15周1/3大鼠的肾上腺、肾脏、脾脏、肝脏、卵巢、子宫、胸腺、肺脏、心脏、脑等器官的外观、体积、颜色等无明显差异，器官亦无出血、充血或者水肿等异常变化。

表 4为各组大鼠重要脏器的脏器系数。通过统计学分析，各组2/3大鼠在13周上药结束后，各器官脏器系数的差异无统计学意义（P>0.05）。各组剩余1/3大鼠在第15周的各器官脏器系数差异亦无统计学意义（P>0.05）。随后，我们把各组第13周与第15周的脏器系数进行对比，各组前后脏器系数的差异无统计学意义（P>0.05）。

表 4 长期毒性试验第13周与第15周大鼠的脏器系数 Tab.4 Organ weights of the rats in the long-term toxicity at 13 and 15 weeks (Mean±SD)
2.3.5 对照组与高剂量组肝脏病理切片

对照组与POD-NLC高剂量组大鼠的肝脏病理切片在高倍镜下均表现为：肝小叶结构明晰，肝索有序，肝窦未见扩张或狭窄。肝细胞大小一致，未见肿大或异型，无气球样变、脂肪空泡等。未见炎性细胞浸润。

3 讨论

既往已有多项研究证明POD与新型载体相结合，较经典用药POD-T在皮肤的毒副作用下降。鬼臼毒素—固体脂质纳米粒（POD-SLN）对豚鼠皮肤无刺激性及致敏性[13]。羧基化碳纳米管负载鬼臼毒素（PPT-CNTsCOOH）在家兔皮肤刺激性试验中，24 h内为轻度刺激性，72 h后刺激性消失[14]。

然而，国内外尚无把POD与新载体相结合应用在阴道黏膜上的研究。与皮肤组织相比，阴道黏膜呈弱酸性，没有角质层，表面有分泌物。有学者发现，直径小于100 nm的颗粒与200 nm相比更容易受到宫颈黏液的阻碍，不容易到达黏膜上皮[28]。在我们前期的研究中，发现POD-NLC的pH为6.20±0.04，粒径小为（180±20）nm，包封率高，稳定性强。POD-NLC能抑制H8细胞的增殖，诱导凋亡的效果明显优于POD-T。在猪宫颈黏膜上药后药物分布的情况，发现POD-NLC具有黏膜靶向性、缓释性，与POD-T相比血药浓度低，有统计学上有意义（P < 0.05）。因此，POD-NLC的弱酸性质、适宜粒径、黏膜靶向性、缓释性及有效性，是支持其在阴道黏膜应用的研究基础。

本实验在既往研究的基础上，通过刺激性试验、急性毒性试验及长期毒性试验证明，POD-NLC在阴道黏膜应用的安全性较大。刺激性是指非口服的化学药物经阴道、直肠等给药后，对用药局部产生的可逆性炎症反应[29]。本研究发现，根据刺激性强度分级，0.5% POD-NLC在阴道黏膜用药为极轻刺激性，与经典用药0.5% POD-T对比黏膜刺激性明显减轻，用药局部未出现类似POD-T组的糜烂、溃疡，亦无血尿、死亡等系统的不良反应。该研究结果与PPT-CNTs-COOH、PODSLN等在皮肤刺激性试验结果相类似，POD与纳米载体结合可减轻其毒副作用。参考POD-T在临床应用的间断给药法，每周用药3 d后停药4 d，推测POD-NLC在阴道黏膜实际应用的刺激性可能更小，适用于黏膜部位的应用。

图 3 大鼠肝脏HE染色病理切片在高倍镜下的结果 Fig.3 Pathological section of the liver of the rats in the control (A) and high-dose (B) groups (×400).

急性毒性是指动物在短时间大剂量接触药物后，在观察时间内所产生的局限及系统毒性反应[30]，可以为药物超常规大剂量用药提供动物实验资料。国外曾有病例报道，一名尖锐湿疣患者在皮肤上外用大剂量的POD制剂后，出现脑组织、肝脏、肾脏的病理改变，最后出现死亡[31]。然而，本研究在大鼠阴道黏膜上，24h内应用300倍临床剂量的POD-NLC，大鼠的一般表现、行为活动及各重要器官未见明显异常，与对照组的脏器系数差异无统计学意义（P>0.05）。根据本研究结果初步推断，短时间内在阴道黏膜上应用较大剂量的POD-NLC，安全性较高。

长期毒性是指动物在连续多日给予等级剂量药后产生的毒副作用[32]。一项纳入60名确诊尖锐湿疣患者的临床试验发现，每周1次外用20% POD制剂，持续6周，可导致用药局部的红斑（53.3%）、水肿（56.6%）、溃疡或水泡（66.6%）、瘙痒（50%），而系统症状包括头痛（13.3%）、腹泻（10%）等[33]。本研究在阴道黏膜应用15倍、30倍、60倍临床剂量的POD-NLC，持续13周，未出现上述现象，且各组实验动物的一般表现、行为活动、体质量改变、血常规、血生化、重要器官的脏器系数及肝脏病理均未见明显异常，各组间差异无统计学意义（P>0.05）。长期毒性试验是最重要的临床前安全用药评估，可预测人体用药后的副作用和推测人体用药剂量的安全范围。根据本研究结果，在阴道黏膜较长时间应用60倍临床剂量以下的POD-NLC制剂相对安全。

综上所述，POD-NLC对给药局部及系统无明显毒副作用。与经典制剂POD-T对比，POD-NLC的安全性明显增高；与PPT-CNTs-COOH等其他新型载体的POD研究相比，本研究证明POD-NLC在阴道黏膜应用的安全性较大，填补目前POD治疗黏膜尖锐湿疣患者的研究空白；与目前治疗阴道黏膜尖锐湿疣的物理方法相比，POD-NLC制备工艺简单，治疗简单无创。

本研究仍有一定的不足之处，因实验条件限制，研究均使用啮齿类动物（如大小鼠、兔子等），未在非啮齿类动物身上重复（如狗、猪、猴子等）。两类动物对药物的耐受性可能不一致，具体表现为毒性剂量和毒副作用表现的不同。

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