2018, Vol. 38
2. 中南大学湘雅医学院医学检验系，湖南 长沙 410013
2. Department of Laboratory Medicine, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, China
血流感染引起的菌血症、败血症等是导致患者急性死亡的原因之一[1]。据卫生部全国细菌耐药监测网血流感染细菌耐药监测报告[1]显示，大肠埃希菌是导致血流感染最常见细菌，近年来发现大肠埃希菌ST131型（ST131）是一种高毒力的克隆型，该型别在全球范围内快速扩散[2]，Cho等[3]研究发现韩国大肠埃希菌引起的血流感染中ST131比例为30.9%，Can等[4]发现土耳其大肠埃希菌所致血流感染中，ST131比例4年间从13%上升至23%，而国内关于血流感染中ST131的流行病学研究少见，相关研究[5-6]显示上海的流行率为13.3%~22.2%，董敏等[7]报道浙江地区为8.2%，提示不同国家和地区可能流行情况存在差异，而湖南地区尚缺乏相关数据。
目前研究[8-9]显示ST131菌株主要属于O25b:H4血清型，最近在几个国家也报道了存在一小部分O16:H5 ST131菌株[10-12]。然而，目前全球关于血流感染中ST131的研究，除了Ciesielczuk等[13]报道O16-ST131外，其余研究均未研究O血清型分型[3-7]，或漏检O16亚型[14-15]。因此，研究血流感染中O16-ST131菌株仍十分必要。因此，本研究目的在于研究本地区血流感染大肠埃希菌ST131型的分布、O血清学分型以及耐药性，分析ST131与非ST131耐药性是否存在差异，以及ST131感染者与非ST131感染者临床特征是否存在差异，为防治引起血流感染的ST131的流行和传播打下基础。
1 资料和方法 1.1 研究对象收集中南大学湘雅医院2016年1~12月血液标本中分离的大肠埃希菌菌株144株，同一患者多次分离到的菌株不重复计入。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.2 仪器与试剂Vitek 2全自动微生物鉴定系统及配套用细菌鉴定卡（梅里埃）；Biometra PCR扩增仪（ABI）；电泳仪（Horfer）；凝胶成像及分析系统（SynGene）。血琼脂、MH琼脂（天和）。
1.3 方法 1.3.1 DNA模板提取挑取血平板上经2代纯培养的细菌菌落3~5个于200 µL灭菌双蒸水中磨匀，97 ℃煮沸10 min，快速冰浴冷却2 min，13 000 r/min离心10 min，吸取上清即细菌DNA，作为PCR反应模板备用。
1.3.2 系统发育分群检测参照文献Clermont等[16]方法应用多重PCR对大肠埃希菌进行系统发育分群，所需引物序列见表 1。四重PCR扩增反应体系为24 µL：2× Taq PCR Master Mix 12 µL，引物chuA、yjaA、TspE4.C2上下游引物各1 µL，ArpAgpE上下游引物各2 µL，DNA模板2 µL。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min，两步法94 ℃变性5 s，59 ℃退火及延伸20 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。E组和C组特异性PCR扩增时，需加入trpBA作为内对照，反应体系为20 µL：2×Taq PCR Master Mix 10 µL，引物4 µL（上下游引物各2 µL），trpBA 2.4 µL（上下游引物各1.2µL），DNA模板2 µL，灭菌双蒸水1.6 µL。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min，两步法94 ℃变性5 s，57 ℃（E组）或59 ℃（C组）退火及延伸20 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。对扩增产物进行电泳、拍照，并根据表 2进行结果判读。
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表 1 系统发育群引物序列及产物大小 Tab.1 Primer sequences and sizes of PCR products used in the phylogenetic grouping |
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表 2 系统发育群结果判读 Tab.2 Interpretation of the results of phylogenetic grouping |
参考Johnson等[17]文献，采用等位基因特异性PCR检测pabB和trpA鉴定ST131菌株，采用PCR扩增O分型基因鉴别O16和O25b型别。检测ST131菌株时，PCR扩增反应体系为20 μL：10 × buffer 2 μL，每种dNTPs 200 μmol，Taq酶2 U，MgCl2 1.5 mmol，pabB上下游各20 pmol，trpA、uidA上下游各15 pmol，DNA模板2 μL；检测O16和O25b型别时，反应体系为20 μL：10×buffer 2 μL，每种dNTPs 200 μmol，Taq酶2 U，MgCl2 1.5 mmol，rfbO16及rfbO25b上下游各20 pmol，uidA上下游各10 pmol，DNA模板2 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性5 s，63 ℃（ST131鉴定）或59 ℃（O分型）退火及延伸20 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物电泳、拍照同前。
1.4 临床资料收集收集144例患者的临床信息，如人口学信息（性别、年龄），基础疾病（糖尿病史、高血压病史等），患者来源（医院感染者或社区感染者），感染来源（原发性菌血症，或继发于肺炎、尿路感染等），感染前情况（是否使用激素或免疫抑制剂，是否接受过放疗或化疗，是否做过手术），治疗情况，住院时间及预后（好转、放弃治疗或死亡）等。并比较ST131感染者与非ST131感染者的临床特征有无差异。
1.5 药物敏感性试验采用Vitek 2 compact细菌自动鉴定及药敏分析仪检测细菌对氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、亚胺培南、厄他培南、阿米卡星、氨曲南和复方新诺明等14种药物的敏感性。药敏结果依照2016年CLSI的标准[18]判读。产ESBLs确认试验依据CLSI [18]推荐的纸片法，用头孢他啶（30 µg/片）和头孢他啶加克拉维酸（30 µg/10 µg）以及头孢噻肟（30 µg/片）和头孢噻肟加克拉维酸（30 µg/10 µg），分别测量两种纸片单独和加克拉维酸的抑菌圈直径，任何一种加克拉维酸较不加克拉维酸的抑菌圈直径增加≥5 mm可确认为产ESBLs菌株。多重耐药（MDR）的标准为对3类或3类以上药物耐药[19]。并比较ST131菌株与非ST131菌株耐药性有无差异。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，构成比或率的比较用χ2检验或Fisher确切概率计算法，正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较用两独立样本的t检验；非正态分布的计量资料采用中位数，四分位间距（Median，IQR）表示，两组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 系统发育分群结果在144株大肠埃希菌菌株中（表 3），可见B2群菌株占最大比例41.0%（59/144），其次分别为F群、B1群和E群，分别占16.7%（24/144）、13.9%（20/144）和13.2%（19/ 144）。
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表 3 2016年湘雅医院血流感染分离大肠埃希菌分群情况 Tab.3 Phylogenetic grouping of E. coli isolates from patients with bloodstream infections in Xiangya Hospital in 2016 (n=144) |
PCR结果显示144株大肠埃希菌菌株中，共有9株（6.3%）属于ST131型，都为系统发育B2群。对这9株ST131菌株进一步进行O血清学分型，显示其包括8株（88.9%）O25b-B2-ST131和1株（11.1%）O16-B2-ST131。
2.3 ST131感染者与非ST131感染者临床特征比较在9例ST131感染者中，男性6例，女性3例，年龄0~70岁，平均42岁。患者的科室分布移植科3例，肿瘤科1例，胰胆外科1例，感染科1例，产科1例，新生儿科1例，急诊科1例。医院感染患者有7例，占77.8%。8例（88.9%）患者有基础疾病，其中4例含有2种及以上基础疾病，4例患者有肾脏疾病，包括肾移植术后2例，肾脓肿1例，肾积水1例。有3例患者是手术后感染，2例患者1月内接受过化疗。7例（77.8%）患者使用2种及以上抗菌药物治疗。有1例患者预后差，最终死亡，其余8例患者均好转出院。与非ST131患者相比，二者临床特征并无明显差异（表 4）。
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表 4 ST131感染者与非ST131感染者临床特征比较 Tab.4 Comparison of clinical characteristics between patients with ST131 and non-ST131 infections |
ST131型菌株对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素以及复方新诺明耐药率>50%，ESBLs阳性率达77.8%，多重耐药率高达88.9%，并高于非ST131型菌株，但差异并无统计学意义（表 5）。
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表 5 血液分离ST131与非ST131型菌株的耐药性比较 Tab.5 Comparison of antimicrobial resistance between ST131 and non-ST131 isoaltes from patients with E. coli bacteremia |
在全球范围内，肠外致病性大肠埃希菌是导致尿路感染、血流感染和脑膜炎的主要原因[20]。肠外致病性大肠埃希菌进入血流后诱发强烈的宿主炎症应答，从而引起败血症，导致血流感染的高发病率和死亡率[21]。大肠埃希菌ST131型被认为是主要的肠外致病性大肠埃希菌[22-23]。本研究结果显示，在血流感染的大肠埃希菌中ST131型别占6.3%，低于国内外的报道[3-7]，提示ST131还未在本地区血流感染中形成大规模流行，可能存在其他引起血流感染的优势克隆型，需进一步检测。
已有研究认为O25b:H4是ST131菌株最主要的血清型[22, 24]，而最近在少数几个国家发现的O16:H5血清型，仅占ST131菌株的一小部分比例[12, 25-26]。然而在全球有关血流感染大肠埃希菌的研究中，仅有Ciesielczuk等[13]在2015年研究发现，在英国血液和尿液中分离的143株ST131菌株中检出12株O16-ST131，但其并未区分具体标本来源。本研究结果显示，9株ST131型菌株包括8株O25b-B2-ST131和1株O16-B2-ST131，因此，本研究系国内首次发现血流感染中存在O16-ST131菌株，但菌株数量太少，为研究其分子流行特征需扩大样本量进一步筛查。
国外有研究认为大肠埃希菌菌株起源与系统发育群有关，同一个系统发育群的菌株可能存在共同的祖先，不同系统发育群致病力亦不相同[12, 27]。Wang等[5]研究发现血流感染中大肠埃希菌主要是B2群，其次是D群、B1群和A群。本研究结果显示，引起血流感染的大肠埃希菌主要为B2群，而F群菌株数量仅次于B2群，与Wang等[5]报道并不一致，原因可能是本研究采用最新的分群方法[16]，更加细分出F群，目前采用这种新方法进行血流感染大肠埃希菌分群的文献报道罕见，关于F群菌株的特征有待进一步研究。
国外有研究[28-29]发现ST131感染多来源于社区感染，但Cho等[3]研究也发现ST131血流感染的患者中有67.6%的感染者来自医院感染，而本研究结果显示ST131感染以医院感染为主，与Cho等[3]报道一致。Chung等[30]研究发现ST131感染者比非ST131感染者更易继发于尿路感染，本研究结果显示，ST131感染者的人口特征和临床特征与非ST131感染者相似，ST131感染者尿路感染比例比非ST131感染者高，但差异并无统计学意义，与Cho等[3]报道一致。虽然已有的文献[30-31]报道ST131具有更多的毒力因子，但本研究结果显示ST131感染者的预后并不比非ST131感染者预后差。
药敏结果显示，血液分离大肠埃希菌ST131菌株对头孢唑林、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素以及复方新诺明耐药率较高，ESBLs阳性率与多重耐药率均较高，结果与国内外相关报道[5, 32]相似，虽高于非ST131型菌株，但差异并无统计学意义，与Chung等[30]报道一致。本研究中ST131对环丙沙星耐药率为77.8%，Cho等[3]报道韩国血流感染中ST131菌株对环丙沙星耐药率高达94.1%，可能是由于地理位置不同及各地用药习惯差异所致。对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南、阿米卡星耐药率较低，提示对于ST131引起的血流感染可优先选择这类药物进行经验性治疗。
综上所述，本地区血液分离大肠埃希菌中，B2群和F群为最常见系统分群，ST131型菌株检出率较低，国内首次在血流感染中分离出O16-ST131菌株，ST131感染者的临床特征与非ST131感染者相似，ST131型菌株多重耐药率及ESBLs阳性率高，应引起重视。
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