2018, Vol. 38
2. 暨南大学附属第一医院，广东 广州 510000;
3. 广州医科大学附属第三医院，广东 广州 510150
2. Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510000, China;
3. Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, China
类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病,其病理特征为炎症反应和炎症细胞因子分泌增多。RA临床表现为长期慢性炎症浸润、关节疼痛、关节肿大和关节畸形[1]。流行病学研究发现世界女性类风湿关节炎发病率约为1.16%,男性为0.44%[1]。类风湿关节炎发病机制主要有炎症细胞因子学说、T细胞学说、Th17细胞学说等[2],但是,其详细的发病机制尚不清楚。炎症反应是类风湿关节炎最重要的致病机制[3]。研究显示阻断类风湿关节炎的炎症反应,如敲除IL-1,或是用抗体阻断IL-6或拮抗TNF-α等可明显改善类风湿关节炎疾病状态或类风湿关节炎动物模型中炎症浸润和骨关节破坏[4-5]。因此,寻找新的靶点或药物来抑制炎症细胞因子分泌和炎症反应对治疗类风湿关节炎至关重要。
P2X7受体是嘌呤受体中的一个亚型,为ATP控制的离子通道,在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞中高等表达[6],其被ATP激活后导致K+外流和Ca2+内流、非选择性膜孔形成,启动一系列信号途径如NF-κB信号通路和促进炎症细胞因子转录,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等多种炎性细胞因子的释放,参与炎症的发生发展[7]。研究表明P2X7受体在真菌感染、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、脊髓损伤、炎症性神经痛、高血压、糖尿病等多种炎症相关疾病中扮演重要角色[8-9],但是,其在类风湿关节炎中作用和分子机制尚不清楚。本论文拟研究P2X7受体在RA患者滑膜组织中表达及其在RA患者诊断中意义;同时研究其调控炎症细胞因子作用。
1 材料和方法 1.1 标本收集RA患者和骨关节置换患者标本来自于广州市增城区新塘医院、广州医科大学附属第三医院,暨南大学附属第一医院。其中,骨关节置换患者选取摔倒等各种原因导致粉粹性骨折且不是类风湿关节炎的病人。收集患者的临床资料、关节滑膜组织和病人血清进行后续的研究。关节滑膜组织采用无菌收集,手术后取关节滑膜组织于干净无菌的50 mL离心管中,置于冰上,于无菌操作台剥除脂肪组织、骨头、血管等后,用PBS洗3遍,冻存于液氮罐中,用于后续实验研究。所有患者资料和标本收集都严格按照新塘医院伦理委员会、广州医科大学伦理委员会和暨南大学伦理委员会相关规定进行。
1.2 试剂IL-6、IL-8和IL-1β的ELISA检测试剂盒(GenStar);SYBER Green试剂盒(宝生物);P2X7受体小分子干扰片段(锐博);转染试剂Lipo2000(Invtrogen life);细胞培养液DMEM (Hyclone);细胞培养皿等耗材(康宁)。
1.3 细胞培养MH7A细胞为永生化的RA关节滑膜细胞,购自广州吉妮欧公司。用高糖DMEM+10%胎牛血清于5% CO2,37℃的培养箱培养。购买时为第3代,培养3代后用于后续实验研究。
1.4 P2X7受体干扰实验特异性敲低P2X7受体的siRNA小分子干扰片段购自锐博公司。P2X7受体干扰实验具体方法如下:MH7A细胞种植于六孔板中,待其融合度为40%~70%,换上无双抗的培养液,按照Lipo2000转染试剂说明书,每孔转染特异性敲低P2X7受体的siRNA小分子干扰片段100 pmol,转染6 h后,撤掉旧培养液,换上含有双抗培养液进行培养,继续培养2 d后收集MH7A细胞RNA和培养上清,检测炎症细胞因子IL-1β、IL-6转录和分泌水平。
1.5 qRT-PCR实验qRT-PCR用来检测RA患者滑膜组织P2X7受体和MH7A细胞炎症细胞因子IL-1β、IL-6相对表达水平。实验步骤如下:收集处理好滑膜组织或MH7A细胞RNA,逆转录后,用SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验。PCR条件为:96℃ 30 s,1个循环;PCR反应,96℃ 5 s,60℃ 15 s,45个循环;溶解,96℃ 15 s,65℃ 20 s,96℃ 15 s,1个循环。PCR结束后,根据相应的公式,以标准曲线进行校正,计算出mRNA的相对表达。
1.6 ELISA实验ELISA实验用来检测MH7A细胞上清中炎症细胞因子IL-1β和IL-6水平,具体实验方案如下:收集处理好的MH7A细胞培养上清,12 000 r/min离心10 min,收集上清,按照GenStar ELISA试剂盒说明进行试验。
1.7 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示;RA患者滑膜组织P2X7受体相对表达水平和血清中炎症细胞因子和相关指标采用t检验;ROC曲线分析用来判断P2X7受体对RA诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 类风湿关节炎患者滑膜组织中P2X7受体水平骨关节置换手术患者和类风湿关节炎患者相关指标和临床资料见表1。分别检测25例RA患者和25例骨关节置换手术患者滑膜组织中P2X7受体水平。结果显示,与骨关节置换手术患者相比,RA患者滑膜中P2X7受体水平明显高于骨关节置换手术患者(图1A)。
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表 1 骨关节置换患者、类风湿关节炎病人相关信息统计 Tab.1 Clinical characteristics of patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis (RA) |
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图 1 两组滑膜组织中P2X7受体水平 Fig.1 Expression of P2X7 receptor in the synovial tissue of patients with RA and joint replacement (***P<0.001) |
为了验证P2X7受体水平对RA患者的诊断价值,我们进行ROC曲线分析。结果显示,AUC面积为0.884,表明P2X7受体对RA的诊断具有较好价值(图2A);同时ROC曲线分析表明P2X7受体对RA诊断敏感性和特异性分别为80%和92%;95%置信区间为0.780-0.998。
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图 2 P2X7受体水平在RA中诊断价值 Fig.2 Diagnostic value of P2X7 receptor level for RA |
收集RA患者血清,检测RA患者血清中RF、L-1β、IL-6、IL-8水平。RA患者相关指标临床资料和检测结果见表1。相关性分析发现,P2X7受体水平与RA患者血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8呈正相关(表1,图3A-C),但是,P2X7受体水平与RA患者血清RF并没有相关性(表1,图3D),表明P2X7受体与RA炎症反应密切联系,可能在RA的炎症反应中扮演着关键作用。
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图 3 RA患者滑膜组织P2X7受体水平和血清中炎症因子水平相关性分析 Fig.3 Correlation between P2X7 receptor level in the synovial tissue of RA patients and serum inflammatory factors A: P2X7 receptor is positively correlated with serum IL-1β (P<0.001); B: P2X7 receptor is positively correlated with serum IL-6 (P<0.001); C: P2X7 receptor is positively correlated with serum IL-8 (P<0.001); D: Correlation analysis between P2X7 receptor level and serum RF level |
干扰P2X7受体后,关节滑膜细胞MH7A的炎症细胞因子L-1β和IL-6表达水平明显下调(表2,图4A、B),与此对应的是,关节滑膜细胞MH7A培养上清中L-1β和IL-6含量也明显下调(表2,图4C、D)。
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图 4 MH7A关节滑膜细胞中干扰P2X7受体后炎症因子的表达和分泌 Fig.4 Expression (A) and secretion (B) of inflammatory factors in MH7A cells transfected with siRNA-P2X7 receptor |
类风湿关节炎是一种自身免疫性、以炎症细胞因子浸润和慢性炎症反应的疾病。RA临床表现为关节慢性炎症浸润、关节疼痛、关节肿大和畸形。及早诊断类风湿关节炎和抑制炎症反应对类风湿关节炎治疗和预后至关重要[10-11]。本论文中,我们发现P2X7受体在类风湿关节炎患者滑膜组织中高表达,且对类风湿关节炎具有较好的诊断价值。此外,P2X7受体与炎症细胞因子密切相关,抑制P2X7受体的表达可抑制关节滑膜细胞的炎症细胞因子分泌和炎症反应,表明P2X7受体不仅是类风湿关节炎的诊断标志物,也是治疗类风湿关节炎的潜在靶点。
类风湿关节炎发病过程缓慢,病程久,长达十几年。类风湿关节炎发展到后期导致关机畸形和破坏,严重影响患者的生活和健康[12]。目前类风湿关节炎的诊断包括血清学、影像学和临床症状[13],但是这些指标往往在疾病发展到一定阶段才出现,影响疾病的诊断。血清学检测对类风湿关节炎至关重要,比如,类风湿因子RF和抗环瓜氨酸抗体ACPA。但是,这两个指标特异性和敏感性存在一定的缺陷[14]。P2X7受体是一类离子型配体门控通道,在体内分布广泛,参与免疫反应与炎症反应等过程[15]。文献报道P2X7受体可介导炎症反应信号通路的激活[16-17]。此外,类风湿关节炎中P2X7受体基因存在位点突变,但是P2X7受体基因突变及其在类风湿关节炎中作用尚未清楚[18-19]。这些文献提示着P2X7受体与类风湿关节炎的发生发展及其炎症反应密切相关。首先,我们收集类风湿关节炎病人关节滑膜细胞,检测P2X7受体在类风湿关节炎中表达。实验结果表明P2X7受体在类风湿关节炎患者滑膜组织中明显高于对照组,我们结果与McInnes等结果一致[20-21],他们研究证明P2X7受体在类风湿关节炎患者滑膜组织中高表达且被激活。因为P2X7受体与类风湿关节炎密切相关,且其表达明显升高,我们推测P2X7受体对类风湿关节炎诊断具有价值。ROC曲线分析表明P2X7受体对类风湿关节炎具有较好的诊断价值(AUC=0.884),特异性和敏感性分别为92%和80%,提示着P2X7受体可辅助RF和ACPA诊断类风湿关节炎疾病,是类风湿关节炎潜在的诊断标志物。
炎症细胞因子和炎症反应是类风湿关节炎的主要病理状态。在本实验中我们首先分析P2X7受体与炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8相关性,结果表明P2X7受体与炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8呈正相关,但是与类风湿因子RF无相关,表明P2X7受体除了在类风湿关节炎中具有诊断价值,可能也参与类风湿关节炎的炎症反应过程。为了证明P2X7受体参与类风湿关节炎炎症反应,我们采用小分子干扰片段敲低P2X7受体水平,检测炎症细胞因子的水平和分泌,研究其在类风湿关节炎中作用。实验数据显示小分子干扰片段敲低P2X7受体后,IL-1β和IL-6的转录水平以及滑膜细胞MH7A的上清IL-1β和IL-6分泌明显减少,这些结果表明P2X7受体参与类风湿关节炎炎症反应,是治疗类风湿关节炎的潜在靶点之一。文献报道抑制巨噬细胞P2X7受体后抑制了巨噬细胞产生炎症细胞因子和炎症反应,可保护类风湿关节炎的骨头破坏[22-23],而我们的实验结果在类风湿关节滑膜细胞上证明敲低P2X7受体后抑制炎症细胞因子产生和分泌,表明P2X7受体在类风湿关节炎滑膜细胞和巨噬细胞上都起着抑制炎症反应作用,是治疗类风湿关节炎的重要靶点之一。Stock等[24-26]在临床Ⅱ期实验中发现使用P2X7受体拮抗剂CE-224,535 12周后可明显改善类风湿关节炎的疾病状态,特别是在使用甲氨蝶呤无效的患者中效果更加明显。Soares-Bezerra RJ等人使用高通量筛选方法筛选出一批P2X7受体拮抗剂,同样表明可改善改善类风湿关节炎疾病[27]。但是,在类风湿关节炎滑膜中,P2X7受体是如何调控炎症细胞因子IL-1β和IL-6转录水平和分泌尚,以及类风湿关节炎P2X7受体如何被激活尚未清楚。文献报道细胞外ATP信号可通过P2X7受体调控炎症过程[28-29];也有文献报道P2X7受体可介导组织蛋白酶蛋白的释放过程进而参与炎症反应[23]。类风湿关节炎滑膜中P2X7受体是否也通过细胞外ATP信号或组织蛋白酶蛋白的释放过程进而调控炎症细胞因子IL-1β和IL-6分泌和炎症反应是我们研究的下一个方向。
本研究证明P2X7受体在RA患者中表达升高,且与RA炎症反应密切相关,对RA的诊断具有较好的价值;此外,阻断P2X7受体抑制炎症细胞因子的转录和分泌,从而抑制RA的炎症反应,为RA的治疗提供了新的靶点和治疗方案,具有一定的临床意义。
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