直至2017年年底，全球新增HIV感染人数有1.8百万^[1]，艾滋病仍然是全球关注的公共卫生问题，其中性传播是HIV最主要的传播方式^[2-3]。因此，预防HIV性传播是抑制HIV传播的重要手段^[4-5]。杀微生物剂在预防HIV性传播中的作用越来越被重视，其是联合国艾滋病规划署和世界卫生组织定位全球优先发展的预防HIV传播策略。杀微生物剂在性交前置入阴道或肛门，能直接灭活HIV、阻止HIV粘附及入侵阴道或直肠粘膜内的靶细胞、抑制HIV在靶细胞内的复制从而预防HIV和其他性传播病原体传播^[6]。杀微生物剂能使性伙伴即使在不使用安全套的情况下也能避免感染HIV，对于在女性地位低下的国家和性工作者预防艾滋病非常必要^[7]。同时，男男同性恋传播HIV的比例在近几年逐年上升^[8]，因此开发能预防男男同性恋性传播的直肠杀微生物剂也十分迫切。

迄今为止尚未有一个杀微生物剂问世，原因在于杀微生物剂的开发专注于抗逆转录病毒药物，却忽略了能促进病毒感染并降低抗病毒药物药效的精源性淀粉样纤维的存在^[9-10]。精源性淀粉样纤维的主要成分是前列腺素磷酸酶（PAP）裂解的多肽PAP248-286自我组装形成的淀粉样纤维^[11-12]。而由PAP248-286聚合形成的淀粉样纤维也被称为精液来源的病毒增强因子（SEVI）。如金属离子和非天然氨基酸抑制剂，可抑制SEVI淀粉样纤维的形成。虽然能有效抑制SEVI作用，但是单作用机制单一，比如单纯作用在原型多肽上，并不能抑制精液中已有的淀粉样纤维增强病毒感染的作用；或者单纯作用在淀粉样纤维形成过程，对已经形成的淀粉样纤维无效。那么能否找到既具有抑制精源性淀粉样纤维的形成，又能作用在淀粉样纤维上的多效化合物呢？

本课题组前期研究发现HIV-1进入抑制剂ADS-J1具有多效的拮抗SEVI淀粉样纤维作用，既能抑制SEVI，又具有抗病毒效果^[13-14]。但由于ADS-J1分子结构中的偶氮键，具有致癌作用，严重限制了ADS-J1的临床应用。通过筛选了一系列ADS-J1结构类似物，发现磺酸类化合物PSB0739能有效抑制SEVI形成并且有良好的抗病毒效果。本研究通过刚果红染色法直接检测PSB0739对PAP248-286形成SEVID的影响、透射电镜法直接观察PSB0739对SEVI形态的影响、病毒感染使用检测PSB0739对淀粉样纤维的作用各测定PSB0739对SEVI表面电势的干扰等；同时验证其抗病毒活性及细胞毒性初步评价PSB0739的安全性，从不同角度探究PSB0739对SEVI的抑制作用，旨在从PSB0739拮抗HIV性传播过程的多效靶点阐述其用于预防HIV性传播的新的可能及机制，从老药新用的角度寻求扩大PSB0739临床适应性的可能，为预防HIV性传播杀微生物剂的研发提供新的研究思路（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 PSB0739的化学结构式 Figure 1 Chemical structure of PSB0739.

TZM-bl、Hela细胞株由本实验室保存；感染性克隆病毒CCR5受体嗜性的SF162质粒由乌尔姆大学Jan Münch教授惠赠。

PSB0739（Target Molecule Corp）；多肽PAP248-286（纯度大于95%）（中科亚光生物）；刚果红试剂；电镜碳膜铜网（主流贸易）；3%磷钨酸（君瑞生物）；转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）（起福生物）；细胞裂解液（Promega）；荧光素酶检测试剂盒（Promega），MTT（华盛奇生物），及其他常规化学分析试剂（Sigma）。

Thermomixer恒温震荡仪（Eppendorf）；透射电子显微镜（日立）；Genios Pro型酶标仪（Tecan）；生物安全柜（ESCO）；Zetasizer纳米粒度电势仪（马尔文）。

多肽PAP248-286（440 μmol/L）与PSB0739混合孵育，使各组样品中PSB0739的摩尔浓度分别是PAP248-286的0.5倍、1倍、5倍（即PSB0739的浓度分别为220、440、2200 μmol/L）。样品混合均匀，在37 ℃下1400 r/min震荡；不同时间点下（2、4、8、12、24、48 h），取出10 μL样品，与90 μL刚果红溶液充分混匀；暗处反应15 min；混合物13 000 r/min离心5 min，小心弃去上清，用50 μL DMSO溶解沉淀，置ELISA半孔板中，使用酶标仪测定其吸光度值（A），测定波长为490 nm，参比波长为650 nm。

多肽PAP248- 286（440 μmol/L）和不同浓度的PSB0739混匀，置于37 ℃振荡器中在1400 r/min转速下反应，于4、24 h分别取样；稀释样品至30 μmol/L（PBS稀释），滴于铜网上，2 min后用滤纸吸去多余液体，磷钨酸（3%，pH7.0）染色2 min，用滤纸吸去多余液体并用超纯水洗1次，铜网自然干燥，用投射电子显微镜直接观察淀粉样纤维形态的变化。

在平皿中接种293TX细胞，细胞密度为3×10⁵/mL，37 ℃培养至细胞密度为80%，转染提前1 h更换新鲜完全培养基，采用PEI转染试剂转染R5嗜性克隆病毒质粒，质粒与PEI按1: 3（质量与体积比）比例在空白培养基中混合均匀，室温孵育30 min，然后慢慢滴加到细胞中；转染16 h后，更换新鲜的含10% FBS的DMEM培养基；24 h后，收集细胞上清，过滤，分装，置于-80 ℃冰箱，备用。

TZM-bl细胞接种于96孔板，1×10⁵/mL，100 mL/孔，37 ℃培养过夜；空白培养基2倍倍比稀释病毒液6个浓度，50 μL/孔加到细胞中，每孔补加50 mL空白培养基，以细胞孔作为空白对照，培养48 h后，利用荧光素酶检测试剂盒检测病毒滴度：弃细胞培养上清，用PBS清洗1次，50 μL/孔细胞裂解液，裂解20 min，取30 μL/孔细胞裂解液至96孔白色平底荧光素酶检测板中，每孔加入50 μL荧光素酶底物，立即用酶标仪测定荧光值。

多肽PAP248- 286（440 μmol/L）和不同浓度的乳酸混匀，置于37 ℃振荡器中，在1400 r/min转速下反应，不同时间点（0、2、4、8、12、24、48 h）取适量样品保存于EP管中备用；TZM-bl细胞接种于96孔板，细胞密度为1×10⁵/mL，100 μL/孔，37 ℃培养过夜；样品5000 r/min室温离心10 min，弃上清，空白培养基重悬样品，病毒（12 ng/孔，以p24计算）与样品体积比为1: 1混合，室温放置5 min，将100 μL混合液加入细胞中，感染3 h后更换新鲜培养基；48 h后，弃去培养基，PBS洗涤2次，利用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光，计算病毒感染增强倍数。

多肽PAP248-286（440μmol/L）置于37 ℃振荡器中在1400 r/min转速下反应48 h后，再与PSB0739混匀，继续震摇48 h后利用Zatasizer纳米粒电势仪检测电势变化。

两种细胞分别接种于96孔平板中，细胞浓度为1×10⁵/mL，37 ℃，5% CO₂培养过夜，配制药物，药物浓度从250 μmol/L开始2倍倍比稀释，稀释8个浓度梯度。药物加入细胞中，培养48 h，小心吸取上清，加入0.5 mg/mL MTT工作液，孵育4~8 h，小心吸干净上清，加入150 μL DMSO溶解沉淀，酶标仪检测其吸光度值，检测波长A_{570 nm}。

TZM-bl细胞接种于96孔板，细胞密度为1×10⁵/mL 37 ℃培养过夜；药物浓度从250 μmol/L开始倍比稀释，稀释8个药物浓度梯度。将药物与病毒等体积混合，混合液加入细胞中，37 ℃培养48 h后，弃去培养基，PBS洗涤2次，利用荧光素酶检测试剂盒检测，计算药物抗病毒感染效果。

直方图均采用Excel进行处理。采用SPSS.22.0软件对实验数据进行统计，实验数据以均数±标准差表示。数据采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法，方差不齐则用Dunnett T₃检验法，当P < 0.05时差异具有统计学意义。

多肽PAP248-286刚果红染色结果：440 μmol/L的PAP248-286多肽在8 h内迅速淀粉样纤维形成，24 h后接近稳定，淀粉样纤维的生长曲线呈典型的S型（图 2）。当加入不同浓度的PSB0739后，淀粉样纤维形成受到不同程度的抑制，并且在24 h内已经开始起作用，其中0.5倍量的PSB0739能降低SEVI的形成，5倍量的PSB0739抑制作用最为明显，基本表现为完全抑制。

图 2(Figure 2)

图 2 PSB0739抑制PAP248-286纤维化的量效关系曲线 Figure 2 Time-response curve of PSB0739 for inhibiting fibrillogenesis. of PAP248-286 (n=3, Mean±SD).

为了直观地观察PSB0739对多肽PAP248-286组装形成淀粉样纤维过程的影响，我们通过TEM观察淀粉样纤维形态变化（图 3）。在4 h时，单纯多肽PAP248-286已经开始形成淀粉样纤维（图 3A），而加了药物作用的样品均未观察到有纤维团（图 3B~D），24 h时，单纯多肽已经形成了明显可观察到的大团粗壮的纤维（图 3E），PSB0739处理后的样品仅观察到小团的纤维（图 3F、G），并且随着PSB0739浓度的升高，电镜视野中找不到纤维的存在（图 3H）。

图 3(Figure 3)

图 3 PSB0739抑制PAP248-286形成淀粉样纤维的透射电镜图 Figure 3 Transmission electron microscopy of the inhibitory effect of PSB0739 on fibrillogenesis in PAP248-286 (Original magnification: ×10 000). A, D: PAP248-286(2 mg/mL); B, F: PAP248-286+0.5×PSB0739; C, G: PAP248-282+2×PSB0739; D, H: PAP248-286+8×PSB0739).

使用R5受体嗜性的HIV-1感染TZM-bl细胞，检测PSB0739存在的情况下形成的淀粉样纤维SEVI增强病毒感染能力（图 4）。单纯的多肽PAP248-286组中，8 h时可明显看到其增强病毒感染作用高达150倍，随着时间延长，增强作用也在逐渐增强，在48 h时SEVI的增强病毒感染倍数有300倍。加了不同浓度的药物处理后，SEVI的增强作用开始降浓度依赖性地降低。

图 4(Figure 4)

图 4 PSB0739抑制PAP248-286纤维化的量效关系曲线 Figure 4 Dose-response curve of PSB0739 for inhibiting fibrillogenesis of PAP248-286 (n=3, Mean±SD).

采用Zetasizer纳米粒度电势仪测定PSB0739对SEVI表面正电势的影响。未经药物处理的SEVI表面带明显的正电荷，Zeta电势在+27 mV左右，用0.5倍量的PSB0739处理后表面电势开始降低，而加入1倍量的PSB0739后正电荷降低接近1半，加入5倍量的PSB0739后表面电荷由正电荷+27 mV转变为负电荷- 15 mV。与SEVI组相比有统计学差异（P < 0.05，图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 PSB0739对SEVI Zeta电势的影响 Figure 5 Effect of PSB0739 on Zeta potential of PAP248- 286 (n=3, Mean±SD).

采用MTT法检测PSB0739对Hela细胞活力的影响（图 6），体外评价PSB0739对生殖道相关细胞的毒性作用。对实验结果进行单因素方差分析，P=0.4373，方差齐性。发现PSB0739浓度从0.015 μmol/L~62.5 μmol/L中，Hela细胞存活率基本保持不变，且均接近100%，实验组与细胞对照组之间采用LSD检验法分析，差异无统计学意义（P>0.05）。

图 6(Figure 6)

图 6 PSB0739对Hela细胞毒性作用 Figure 6 Cytotoxic effects of PSB0739 in Hela cells (n=3, Mean±SD).

采用体外抗病毒实验检测PSB0739的抗病毒活性，发现PSB0739能直接抑制HIV感染（图 7A）。其抗HIV-1 IC₅₀为21.77±5.15 μmol/L，并且该浓度下PSB0739对TZM-bl细胞无抑制作用（图 7B），对实验结果进行单因素方差分析，P=0.4373，方差齐性，加药组与细胞组之间的比较采用LSD检验法分析，差异无统计学意义（P>0.05）。

图 7(Figure 7)

图 7 PSB0739抗病毒活性试验 Figure 7 Assessment of antiviral activity of PSB0739. A: Antiviral activity of sulfonic compounds PSB0739; B: PSB0739 is minimally cytotoxic in Hela cells (n=3, Mean±SD).

淀粉样纤维是一个高度有序的蛋白聚集体，形成过程是一种核的聚集过程，多肽单体通过疏水作用结合聚集形成纤维核，之后更多的单体分子聚集在纤维核上延长形成原纤维，原纤维再聚集形成成熟的淀粉样纤维，只有形成淀粉样纤维才能增强病毒感染^[15-17]。成熟的淀粉样纤维延伸像手臂一样拉近病毒颗粒与靶细胞之间的距离，增加HIV与靶细胞的接触从而增强病毒感染^{[10, 18-19]}，抑制淀粉样纤维的形成和影响淀粉样纤维的正常结构或活性，是目前抑制淀粉样纤维增强病毒感染作用的主要策略^[20]。刚果红是一种能与淀粉样纤维特异性结合的染料，结合后在490 nm波长附近吸收值升高^[21]，可用于检测PSB0739对精液淀粉样纤维形成的影响。本文首先通过刚果红染色法定性检测了PSB0739对淀粉样纤维形成的抑制作用，然后通过投射电子显微镜法直接观察PSB0739对纤维结构的作用。上述两种实验方法的研究结果共同证明，PSB0739能浓度依赖地抑制淀粉样纤维的形成。

此外，精液中的淀粉样纤维具有极强的阳离子特性，研究表明淀粉样纤维能直接吸附带负电的HIV病毒颗粒，使病毒在靶细胞表面富集，促进病毒和靶细胞吸附和融合，从而增强病毒感染^[22]。因此，本文章从淀粉样纤维生理功能及生理活性上分别研究PSB0739对精液淀粉样纤维增强病毒感染能力和表面电荷的影响。通过病毒感染检测PSB0739对精液淀粉样纤维病毒感染增强作用的影响；同时设置不同浓度的PSB0739分别与成熟的淀粉样纤维孵育48 h通过马尔文电势粒度仪直接检测精液淀粉样纤维表面电势。以上两个实验均说明PSB0739能有效影响精液淀粉样纤维的病毒感染增强能力。

药物的疗效与副作用影响着药物在临床的应用。口服的抗逆转录药物是应用最广泛的抗HIV治疗手段，然而这些药物均具有不同程度的毒副作用，如全身毒性，粘膜局部药物浓度低于最佳水平，甚至出现肝肾功能损伤。而局部使用的杀微生物剂，则避免了全身给药带来的毒性反应，同时减少由于首过效应造成的局部作用浓度低的影响^[23-25]。壬苯醇醚（N-9）是最早被列为杀微生物剂候选药物，但研究表明，N-9可以导致宫颈、阴道及外阴上皮细胞的破损，这些破损又增加了HIV和其他性传播疾病病原体的感染机会^[26-27]，与杀微生物剂开发初衷相悖。PSB0739与N9相比有更良好的安全性，本研究用Hela细胞简单评价体外PSB0739对细胞的毒性作用，MTT实验结果表明PSB0739对Hela细胞毒性低。

目前在临床试验阶段联用的杀微生物剂有Tenofovirl和PRO 200 ^[26]。本研究课题组前期研究发现酸酐修饰卵清蛋白、ADS-J1能与多种机制的候选杀微生物剂合用，具有不同的协同抗病毒作用^[28-29]。这些研究让我们确信，不同作用机制的杀微生物剂联合应用，可提高抗病毒疗效、减低毒副作用。一药多靶点不仅能带来更好的治疗效果，而且能降低多药联用带来的毒副作用。因此PSB0739可以考虑通过与其他抗病毒药物联用，开发为多效杀微生物剂。

综上所述，PSB0739对精源性淀粉样纤维SEVI具有多重功效，既能抑制淀粉样纤维的形成，直接阻断SEVI和病毒的结合，同时也能作用在成熟的淀粉样纤维上中和其表面电荷，从而抑制淀粉样纤维与病毒通过静电作用的结合。同时PSB0739能直接作用于HIV的感染。PSB0739是一种高效的PY2受体阻滞剂，成药性好^[30-31]，PSB0739有望开发为同时作用于病毒和宿主两个方面不同环节的新型杀微生物剂或添加复方成分的抗病毒药物，用于艾滋病的预防与治疗。